拟茎点霉基因组分析与松脂醇及其糖苷化合物合成途径解析

发布时间：2020-09-07 18:51

　　 松脂醇[(+)-pinoresinol](Pin)及其糖苷类化合物—松脂醇单葡萄糖苷[(+)-pinoresinol-4-O-β-Dglucopyranoside](POG)和松脂醇二葡萄糖苷[(+)-1-pinoresinol4,4′-di-O-β-D-glucopyranoside](PDG),均属双环氧木脂素类,具有抑菌、抗癌、降血糖等多种功能活性,但天然含量极低。微生物合成法生产这些物质具有时间短、效率高、不受季节限制等优点,但关于微生物中Pin及其糖苷化合物代谢途径的关键步骤,特别是催化Pin糖基化的关键酶类却少见报道。论文以一株能够合成PDG的杜仲内生菌——拟茎点霉XP-8为材料,通过基因组和转录组分析,在基因水平上解析Pin及其糖苷化合物的代谢途径;并综合关键酶抑制剂、前体喂养、关键酶分离纯化与催化特性分析等方法与步骤,在物质转化和蛋白质水平上验证所得代谢途径;最后,以糖基化关键步骤为切入点,通过基因特征分析、酶的分离纯化与酶学特性研究,获得与Pin糖苷化合物代谢相关的糖基转移酶与糖苷酶的编码基因,确定相关合成途径及关键基因。所得主要结果如下:(1)基因组分析揭示拟茎点霉XP-8的代谢途径多样性。通过全基因组测序、组装和注释,获得基因组大小为55.2 Mb,GC含量为53.5%,基因组重复序列占0.83%,含17,094个蛋白编码基因和310个非编码基因,其中,16,025个蛋白编码基因在不同数据库中得到功能注释,占总注释蛋白质编码基因的93.75%。OrthoMCL分析得到11,818个基因家族,其中64个为特有基因家族,1,140个为特有基因,其中163个为特异基因家族基因。通过antiSMASH预测到80个次级代谢合成基因簇;CAZy数据库分析得到大量碳水化合物代谢可能参与Pin及其糖苷化合物合成的相关酶类。(2)转录组分析揭示Pin及其糖苷化合物的合成途径。菌体样本通过测序分析,用从头组装和参考基因组两种方法分析其转录组。得到4.10 Gb的Clean Data,Q30碱基百分比不小于85.02%,与参考基因组的序列比对效率为88.64%,发掘302个新基因。通过与Nr、GO、COG、KEGG等数据库比对,用无参和有参方法进行基因注释,发现有参拼接能够获得更多注释信息,结果优于无参拼接。有参分析中共有2,921条基因被注释到117个代谢途径中。共有180条基因,涉及40个酶参与Pin生物合成,涉及糖酵解途径、磷酸戊糖途径、苯丙氨酸生物合成途径以及苯丙烷途径等代谢途径。并筛选出可能参与Pin糖苷化合物合成的葡萄糖基转移酶基因。(3)酶抑制剂和前体添加法确定Pin和PDG合成途径。莽草酸途径抑制剂三甲胺和EDTA能够强烈抑制Pin与PDG合成;聚酮途径抑制剂浅蓝菌素和碘乙酰胺则对这些物质合成没有影响;莽草酸途径和苯丙烷途径的前体和中间代谢产物均能显著促进Pin与PDG合成。说明,Pin和PDG合成途径涉及莽草酸途径和苯丙烷途径,但不涉及聚酮途径。(4)催化Pin糖基化反应的糖基转移酶的分析。依次通过70%饱和硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose FF离子交换色谱、Sephadex G-100凝胶过滤和SDS-PAGE电泳对菌体的胞内酶进行分离纯化,获得电泳纯酶蛋白,其表观分子量约为49.50 kDa;液相与质谱检测证明,该酶能以Pin和UDP-葡萄糖为底物催化合成POG,但不能催化合成PDG。参考基因组注释结果,成功克隆到三个糖基转移酶基因,生物信息学分析表明其均属GTB超家族,在其N端和C端均有典型的Rossmann折叠,含较多α-螺旋,约占整个分子的46~49%;氨基酸序列同源性分析表明,GT-1和GT-2与其它物种同源性较低,而GT-4与其他物种的同源性可达75%以上。用pET28as和E.coli BL21(DE3)体系对GT-4基因进行原核表达,获得分子量50 kDa左右的表达产物,并具有催化Pin糖基化反应活性。(5)催化Pin糖苷化合物的β-葡萄糖苷酶的分析。依次用70%饱和硫酸铵沉淀、Hitrap~(Tm) Butyl FF疏水层析、Superdex~(Tm) G200凝胶过滤层析对菌体的胞内粗酶液进行分离纯化,得到电泳纯酶蛋白,其表观分子量约93.40 kDa,MALDI-TOF质谱鉴定为β-D-葡萄糖苷酶,在拟茎点霉XP-8基因组中的基因序列为Gglean007197.1,为基因水平上相关研究和基因调控奠定重要基础。纯化后的酶比活力达75.86 U/mg,纯化倍数30.71,回收率17.04%;酶的最适反应温度70°C,在30-70°C范围内热稳定性较好,为一种耐热性葡萄糖苷酶;最适反应pH值5.0,在p H 3.0-7.0范围内有较高酶活性;K~+、Cu~(2+)、Li~+对其催化活性有显著抑制作用,而Na~+、Mg~(2+)对其则有激活作用,Mn~(2+)、Zn~(2+)、Fe~(2+)的抑制作用不明显;在底物特异性方面,该酶对β-1,4-糖苷键和α-1,2-糖苷键有水解活性,对α-1,4和α-1,1糖苷键没有活性,对pNPG和纤维二糖的催化活性最高,其次为β-1,4-糖苷键连接的芳香基化合物。更为重要的是,该酶能够催化POG和PDG的脱糖基反应,说明其与菌株合成Pin糖苷化合物的逆反应有关。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q78;O629
【部分图文】：

图 1-4 三种木脂素类化合物基本的母核结构（王丹等 2017）Fig.1-4 Nuclear parent structure of three kinds of lignans合成木脂素的单体主要有四种（如图 1-3）。根据分子中苯丙素结构单元的聚合方式，可将木脂素类化合物分为木脂素（1ignan）Ⅰ、新木脂素（neolignan）Ⅱ和氧新木脂素（oxyneolignan）III（图 1-4）。苯丙素单体的第 1 个 C6-C3单元的 9 个碳原子分别编号为 1～9，第 2 个 C6-C3单元的碳原子编号为 1'～9'。两个单元分子通过侧链的 β 碳原子缩合形成的聚合体称为木脂素（1ignan）Ⅰ。最早木脂素是指 8-8'连接的二聚体。后来发现在 7-7'、9-9'、7-9'等位置也可以形成四氢呋喃环氧结构以及在 9-9'形成内酯环结构的木脂素，从而形成了不同结构类型的木脂素化合物，如二苄基丁内酯类（dibenzyltyrolactones）、二苄基丁烷类（dibenzyllbutanes）、四氢呋喃类（tetrahydroforans）、联苯环辛烯类（dibenzocycoloctenes）等。通过 β 碳原子以外连接而形成的聚合体统称为新木脂素（neolignan）Ⅱ。之后又把 C6-C3 单元分子之间通过氧原子连接的一些化合物称之为氧新木脂素（oxyneolignan）III。木脂素类化合物的结构复杂，并且具有不同类型的取代基和立体异构体；其生物活性多样化，有抗癌、抗氧化、抗病毒等活性；另外，还可以用作生长抑制剂、植物萌发抑制剂和一些杀菌剂和杀虫剂。

图 1-3 木脂素单体Fig.1-3 Monomerof lignans（1）桂皮酸 cinnamic acid（2）桂皮醇 cinnamyl alcoh（3）丙烯苯 propenyl benzene （4）稀丙苯 allyl benz 1-4 三种木脂素类化合物基本的母核结构（王丹等 20Fig.1-4 Nuclear parent structure of three kinds of lignans单体主要有四种（如图 1-3）。根据分子中苯丙化合物分为木脂素（1ignan）Ⅰ、新木脂素（nen）III（图 1-4）。苯丙素单体的第 1 个 C6-C3单

第一章 文献综述 衍生物依托泊苷、替尼泊苷等已在临床上广泛应用于抗肿瘤和抗病毒治疗（陆炜强等2011）。这些物质主要来自鬼臼属植物，统称为鬼臼类木脂素（podophyllum lignnas）经常食用富含木脂素的食物能够明显降低乳腺癌的发生率。据文献报道，大多数植物木脂素会在肠道菌群的作用下，经过水解、脱甲基、脱羟基、不对称加氢等途径，最终代谢为哺乳动物雌激素肠二醇（Enterolactone，ENL）和肠内酯（Enterodiol，END）。ENL和 END 有预防和治疗雌激素依赖性癌症的作用。在此方面研究最多的是亚麻籽（Linumusitatissimum）木脂素-开环异落叶松脂酚（secoisolariciresinol，SECO）（杨瑞楠 2016）根据研究结果，PDG 会被肠道菌群代谢为松脂素、落叶松树脂素、开环异落叶松脂素肠二醇、肠内酯等 15 个代谢产物，推测其在肠道内的代谢过程主要包括糖苷的水解、甲氧基基团的去甲基化、3,4-二羟基苯基的去羟基化以及呋喃环的开环裂解反应等（Xiet al. 2003）（图 1-5）。

本文编号：2813709