CAR-T生产中病毒载体DNA残留检测方法的建立和优化

发布时间：2020-09-08 13:50

　　运用CAR T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy,嵌合抗原受体T细胞免疫疗法)治疗肿瘤的方法是近年来发展最为迅速的一种肿瘤免疫新疗法。CAR T细胞疗法能克服局部免疫抑制,对肿瘤细胞的杀伤不受MHC(major histocompatibility complex)限制等优势,但同时也必须面对在治疗过程中产生的细胞因子释放综合症(CRS)、脱靶效应和神经毒性等因素的困扰。因此CAR T细胞治疗技术的有效性和安全性还需要研究人员去严格把控。由于CAR T生产过程中细胞培养环境的多样性使得CAR T产品中的杂质复杂多样,即使微量的杂质残留都可能会在人体中产生严重的免疫反应,其中DNA残留是最主要的杂质。残留的外源DNA可能造成插入突变、导致抑癌基因失活、癌基因被激活等,而至今还没有一种全面、准确、合规的检测方法能评价CAR T中间产品—慢病毒载体中的DNA残留。因此本文将采用荧光染料法和qPCR法对慢病毒载体生产和纯化工艺中的样品进行DNA残留检测。PicoGreen荧光染料法检测DNA残留具有检测快速、成本低的特点,但其灵敏度不高,对于特定DNA残留如SV40和E1A等也缺乏有效的检测方法,而qPCR法虽具备特异性强、灵敏度高的特点,却存在只能检测宿主细胞(CHO、Ecoli、Vero),不能检测293T细胞总DNA残留的缺点。为了能更好的完善CAR T生产纯化工艺,全面检测慢病毒载体中的DNA残留,为将来CAR T技术更好地运用于临床实验当中去。本文先运用荧光染料法建立了三套不同的检测范围和灵敏度的总DNA残留检测方法,并针对于实际慢病毒载体生产样品的浓度,选取25~800 ng/mL检测范围的检测方法进行准确度、精密度、专属性、稀释线性和耐用性的验证。随后运用qPCR法通过探针引物的选择、优化,DNA抽提效率的考察后建立了针对于SV40、E1A DNA残留检测的方法,并对这两种方法进行了准确度、精密度、专属性、和耐用性的验证,通过联合运用荧光染料法和qPCR法对慢病毒载体中的DNA残留进行全面、准确、快速、高效的检测。
【学位单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：O657.3;TQ460.72
【部分图文】：

肿瘤细胞,第一信号,肿瘤抗原,分子

原作为内源性抗原可以由肿瘤细胞自身的 HLA-I类分子直接提呈给 CD8+CTL可以由其他抗原提呈细胞（antigenpresentingcell，APC）提呈。众所周知 CD8+CT胞的活化需要双信号刺激，第一信号则是由识别抗原多肽分子（HLA）复合生，而这个识别过程具有双特异性，即胞外可变域特异性识别肿瘤抗原表位此同时 CD8+分子需特异性地识别自身 HLA-1 分子的多态性部位，唯有双特识别才能为 CTL 活化提供完整的第一信号。而我们知道肿瘤细胞的 HLA-1 表达通常是下调的，这就造成了 C8+分子无法特异性地识别 HLA-1 分子，从成了 MHC（MHCmajor histocompatibility complex）限制[1]，肿瘤细胞免于被的细胞免疫系统所发觉和杀伤，从而使得 CTL 及相关的细胞免疫治疗的抗肿用受到了很大的限制。而 CAR T 技术作为细胞免疫治疗（Cellular Immunothera代表，它可以不受 MHC 的限制作用，它能够只识别肿瘤抗原而不需要通过 HLA-1 分子就能活化 CTL，能够使 CTL 细胞本身表达肿瘤抗原受体而不LA-1 类分子的限制，从而绕过树突状细胞 DC 直接识别肿瘤细胞并对其进行,其主要原理如图 1 所示。

时报,证券,工作流程

上海交通大学工程硕士学位论文AR T（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体 T 疗法），其原理就是将胞外特异性肿瘤抗原识别区、铰链、跨膜区以及胞传导域四部分拼接后，通过逆转录病毒或慢病毒载体转染方式将目的基因效应细胞，并使表达抗原特异性的效应细胞，经体外扩增培养后回输注给种细胞免疫治疗技术。CAR T 具体的工作流程为：通过采集患者外周静离出的 T 细胞，使其在多因子细胞诱导下大量扩增，并引入靶向肿瘤抗抗原受体（CAR）。通过 CAR 的修饰可使 T 细胞在获得靶向杀伤能力的得更强的增殖及抗凋亡的能力，其肿瘤杀伤作用的发挥也不会受到主要组复合体（MHC）的限制[1]，最后通过静脉或皮内注射等手段回输入患者到杀伤肿瘤的目的，具体流程见图 2。由于该 T 细胞肿瘤靶向的持续扩和杀伤活性，保证了其对肿瘤细胞造成持续有效的杀伤力，从而使病人的治愈。

原理图,原理,双链,荧光染色法

2.1 方法概述本方法采用 PicoGreen 荧光染色法。PicoGreen 是一种高灵敏度的双链 DNA染料[47,48]，它能直接与 DNA 双链结合形成复合物，结合后的荧光强度也大大增强。双链 DNA 直接与 DNA 荧光染料分子结合后，经带有荧光功能的酶标仪激发后产生荧光信号，其含量与荧光值成正比，原理如图 3 所示。其具体工作流程为：先将供试品进行合适的稀释，再与 PicoGreen 染料等比混合，避光孵育，最后用酶标仪记录 OD 480/520 nm 荧光值，并使用线性法拟合回归模型绘制标准曲线（R2>0.99），计算残留的总 DNA 含量。PicoGreen 染色法可以排除蛋白、盐、聚乙二醇、氯仿、尿素、琼脂糖及乙醇对其的影响，单链 DNA、RNA 对其样品检测的结果影响也很小[ 49,50]。它的优点是检测方便、耗时短、成本低廉，可应用于高通量检测筛选，特别适用于 DNA 含量相对高的样品，比如未经过纯化工艺的上游样品，因此我们在工艺开发纯化过程中经常采用 PicoGreen 荧光染色法对慢病毒载体工艺样品进行检测。目前该方法也已纳入《中国药典》[51]。

【参考文献】