ε-聚赖氨酸生物合成研究与稳定表达载体构建

发布时间：2020-09-27 06:45

　　 ε-聚赖氨酸(ε-PL)作为目前自然界当中已知的两种氨基酸同聚物其中之一,其由L-赖氨酸单体之间通过α-羧基与ε-氨基缩合形成。由于ε-聚赖氨酸具有广谱的抑菌性、良好的水溶性和热稳定性以及很好的生物安全性。因此,ε-聚赖氨酸在一些国家被批准作为天然生物防腐剂使用。除了作为防腐剂使用以外,ε-聚赖氨酸还有很多方面的应用,诸如作为药物载体、食疗剂、生物材料等等。随着ε-聚赖氨酸应用的越来越广泛,对ε-聚赖氨酸的需求也越来越大。因此,构建ε-聚赖氨酸高效表达载体的研究具有非常高的实际意义与应用价值。本研究以在卡特利链霉菌S.cattleya DSM 46488中发现的一对有功能的II型毒素-抗毒素系统relBE2sca搭建一套在无抗生素选择压力条件下ε-聚赖氨酸合成酶稳定表达的新型链霉菌表达系统,以替代传统的抗生素筛选标记的链霉菌表达系统。本研究在S.diastatochromogenes CGMCC3145 pls缺失突变株中,将毒素基因relE2sca整合至突变株的染色体,抗毒素基因relB2sca与S.diastatochromogenes CGMCC3145 pls基因一起克隆至表达载体,构建了无抗生素选择压力条件下ε-聚赖氨酸合成酶稳定表达的新型链霉菌表达系统。同时实验结果表明这套TA系统确实能够延缓ε-聚赖氨酸合成酶表达质粒的丢失。鉴于S.cattleya DSM 46488遗传操作的困难以及目前报道的短链ε-聚赖氨酸产生菌较低的发酵水平,本研究筛选了常用的高效链霉菌表达宿主,以期找到能进行ε-聚赖氨酸合成酶异源表达的高效宿主,并在其中构建ε-聚赖氨酸稳定表达的新型链霉菌表达系统。这样我们就能构建一个高效稳定的短链ε-聚赖氨酸工程菌。但是实验结果表明无论是长链ε-聚赖氨酸产生菌的pls基因还是短链ε-聚赖氨酸产生菌的pls基因都无法在我们选定的异源表达宿主中表达。为了探究pls基因在异源表达宿主为什么不能表达,我们对S.cattleya DSM46488 pls基因双缺失突变株进行了自身pls基因回补以及S.diastatochromogenes CGMCC3145 pls基因的异源表达,我们发现回补了自身质粒pls基因的突变株恢复了短链ε-聚赖氨酸的产生能力但是产量远低于野生型,而长链ε-聚赖氨酸产生菌pls基因不能在S.cattleya DSM 46488 pls基因双缺失突变株中表达,这说明可能除了pls基因,ε-聚赖氨酸的合成还需要其他因素的协助,这也可能是在常用的链霉菌表达宿主中异源表达失败的原因。本研究以淀粉酶产色链霉菌S.diastatochromogenes CGMCC3145和卡特利链霉菌S.cattleya DSM 46488为主要研究目标,成功利用毒素-抗毒素系统relBE2sca搭建一套在无抗生素选择压力条件下ε-聚赖氨酸合成酶稳定表达的新型链霉菌表达系统。为基于relBE2sca构建食品安全级的链霉菌表达系统以及高效便捷的无抗生素选择压力链霉菌表达系统的构建提供了思路。同时通过基因的敲除和回补,探究pls基因是否为控制ε-聚赖氨酸合成的唯一关键因素,为接下来进一步研究ε-聚赖氨酸合成机制奠定了基础。
【学位单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：O631;Q78
【部分图文】：

分子结构图,分子结构,同聚物,赖氨酸

.1 ε-PL 的结构及理化性质ε-聚赖氨酸是一种天然氨基酸同聚物，它与 γ-聚谷氨酸是目前为止自然界有的两种天然氨基酸同聚物[1]，ε-聚赖氨酸是 1977 年日本科学家在筛选放对 Dragendorff 呈阳性反应的过程中发现的[2-4]。ε-聚赖氨酸通常是由 25 L-赖氨酸残基通过 α-羧基和 ε-氨基脱水缩合形成酰胺键连接而成（图 1-子量通常为 2.5~4.5kDa[5]。ε-聚赖氨酸纯品为白色或淡黄色粉末，具有强烈湿性，当分子量较大时有轻微的苦味，其具有良好的水溶性，除了微溶于乙外，不溶于有机溶剂（比如乙酸乙酯和乙醚等等）[6]。ε-聚赖氨酸是混合物包含多个聚合度，它的熔点并不固定，当加热到 250℃开始融化[7]。除此之赖氨酸还具有非常好的热稳定性，即使在 120℃加热 20 分钟，它仍然能保高的活性[8]。

宿主,结合转移,温敏型,宿主基因组

图 1-3 TA 系统在 DNA 克隆方面的应用[44]Figure 1-3 Application of TA systems in DNA cloningA) 目标基因插入破坏毒素基因使得细胞存活。 B) 稳定克隆系统的原理。 C)网关克隆系统的筛选原理。II 型 TA 系统除了被应用于 DNA 克隆之外，Sevillano L 等利用 yefM/yoeB统在变铅青链霉菌中构建了一套稳定的表达系统[45]。他们首先敲除变铅青菌染色体上 yefMsl/yoeBsl 基因；其次，在温敏型质粒连上抗毒素基因，再转移至变铅青链霉菌宿主中；最后，将毒素基因整合到宿主基因组中。将表粒接上抗毒素基因结合转移至变铅青链霉菌宿主，再通过改变温度消除温敏粒，表达目标产物的体系即构建完成（如图 1-4）。

质粒,温敏型,抗毒素,抗生素

图 1-4 基于 TA 系统的稳定表达体系构建[45]Figure 1-4 Construction of stable expression system based on TA system.敲除毒素-抗毒素系统。2.导入包含抗毒素的温敏型质粒 3.整合毒素基因至染色体 4.导入有抗毒素基因和目标基因的表达载体，消除温敏型质粒。没有导入表达载体的将会被毒杀死。在微生物发酵生产过程中，质粒的不稳定性是一个非常严重的问题。为了质粒的丢失，通常是在目标质粒上带上抗性基因，然后在培养基中加入一定的抗生素。但是这样做又会带来一些新的问题，比如生产成本的增加，增加纯化目标产物的难度，同时抗生素的大量使用所造成的环境污染问题。这些使得 TA 系统作为替代抗性标记的新型筛选标记的开发势在必行。.4 本文的立题依据及研究内容

【参考文献】