O-甲基转移酶的克

发布时间：2020-09-30 01:09

　　 O-甲基化反应被运用于化合物的甲基化修饰、芳香醚的生产与羧基基团的保护等,在化合物的合成中具有广泛的应用。由于化工生产中使用的传统甲基化试剂存在高毒性、低选择性等不足,需要开发绿色温和的替代型生产工艺。O--甲基转移酶作为特异性催化O-甲基化反应的生物催化剂,具有反应条件温和、选择性高等优点,在化工生产中有着巨大的应用潜力。除此之外,O-甲基转移酶还是褪黑素、辅酶Q10等天然产物生物合成途径中的限速酶,其活性制约了目标产物生物合成效率。因此,对O-甲基转移酶的研究具有重要的理论意义和应用价值。本文通过基因挖掘构建O-甲基转移酶库,结合多底物筛选的方法,获得了具有广底物谱的O-甲基转移酶AtCOMT(Arabidopsis thaliana Caffeic acid O-methyltransferase);并通过理性设计对 AtCOMT进行了 分子改造,提高了其催化褪黑素生物合成途径限速步骤(N-乙酰-5-羟色胺O-甲基化生成褪黑素)的活性,并在此基础上通过酶催化动力学分析与分子动力学模拟对活性提高的机理进行了探讨。本文具体实验内容和结果如下:(1)通过基因挖掘的方法筛选出不同来源与功能的O-甲基转移酶,通过分子克隆技术在大肠杆菌中进行异源表达,成功克隆了 16个O-甲基转移酶,建立了 O-甲基转移酶库;(2)针对多个具有研究价值且底物易得的O-甲基化反应,建立了相应的检测方法(HPLC、GC),用于筛选合适的O-甲基转移酶。通过多底物的筛选,最终从O-甲基转移库中获得具有广底物谱的AtCOMT;(3)鉴于AtCOMT能够催化N-乙酰-5-羟色胺(NAS)的O-甲基化反应,而此反应已被明确报道为褪黑素异源生物合成途径中的关键限速步骤,以NAS为底物对AtCOMT进行了理性改造。通过对AtCOMT进行同源建模,结合分子对接获得酶-底物复合物的构象,并据此制定理性设计策略,增强酶的活性口袋对底物NAS的结合能力,最终获得三点组合突变体 C296F-Q310L-V314T,活性提高 8.5 倍;(4)通过对野生型AtCOMT与优势突变体的酶催化动力学分析和分子动力学模拟,发现突变体对NAS的亲和性与催化效率都有所提高;296位和310位突变氨基酸与NAS之间的作用力增强;314位突变氨基酸与前两个点突变存在协同作用,并影响了局部的蛋白结构,促进了 310位突变氨基酸与底物之间的结合。综合得出突变体通过增强与NAS的结合作用从而提高酶活性的结论。
【学位单位】：北京化工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：O629.8
【部分图文】：

图１－１邋ｏ－甲基化反应逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｏ－ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ逡逑为邻苯二酚经过Ｏ－甲基化生成愈创木酚；Ｂ为水杨酸经过Ｏ－甲基化生成水杨酸甲酯；Ｃ经过０－甲基化生成克拉霉素。逡逑酶促０－甲基化反应逡逑０－甲基化同样广泛存在于生物体中，而在生物体内进行的０－甲基化与工业中不同；生物体中的０－甲基化反应是在酶的催化作用下，通过活性的甲基供体来，具有反应条件温和、高效与选择性强等优点。酶促０－甲基化反应，在生物体调整修饰基因与蛋白质的作用，并参与到物质合成中．？在原核生物中蛋白质基化能够影响细菌的趋化性信号的传导和抗原表位的变化愈创木基木质组成植物木质素的单体之一，其合成过程中Ｃ３位置需经过０－甲基化反应［２｜，２２］与其他两种单体聚合形成木质素，而后者帮助植物抵御外力破坏、病害与细胞乱等胁迫［２２］。逡逑

修饰以及植物类黄酮的合成等等。儿茶酚胺0－甲基转移酶（Ｃａｔｅｃｈｏｌ－０－ｍｅｔｈｙｈｍｎｓｆｅｒ逡逑ａｓｅ）存在于人的体内，起到代谢儿茶酚类神经递质的作用；其功能是在镁离子的辅助逡逑下，以ＳＡＭ为提供活性甲基的辅酶，０－甲基化儿茶酚胺苯环的Ｃ３位的羟基（图１－２），逡逑而经过０－甲基化修饰的多巴胺则会进一步在体内分解失活；由于多巴胺与精神活动及逡逑躯体运动相关，因此儿茶酚胺？－甲基转移酶对帕金森症、精神分裂症等神经疾病和运逡逑动障碍性疾病具有研宄意义［２４＿２８］。类黄酮0－甲基转移酶（Ｆｌａｖｏｎｏｉｄ邋Ｏ－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒ逡逑ａｓｅ）在生物体内起到对类黄酮物质进行０－甲基化修饰的作用；类黄酮的羟基自由基逡逑经过Ｏ－甲基化修饰后数量减少，由此弱化了葡萄苷酸化作用与硫酸盐的接收，从而增逡逑强了亲脂性与代谢稳定性［２９－３１１。咖啡酰辅酶Ａ氧甲基转移酶（Ｃａｆｆｅｏｙｌ－ＣｏＡ邋３－０－ｍｅｔ逡逑ｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｍｓｅ）是植物体内木质素合成过程中所需的关键酶，可催化咖啡酰辅酶Ａ（Ｃａ逡逑ｆｆｅｏｙｌ－ＣｏＡ）生成阿魏酰辅酶Ａ（Ｆｅｒｕｌｏｙｌ－ＣｏＡ），主要参与愈创木基木质素的合成，并逡逑且与紫丁香基木质素的合成有关，是研究调控植物木质素合成的关键酶［２２】。逡逑、’逦］儿茶赚氧位甲基转移酶逦ｊ逡逑ｎｈ２逦ＮＨ２逡逑ＨＯ逦ＳＡＭ邋ＳＡＨ逦ＨＯ’逡逑图丨－２儿茶酚胺０－甲基转移酶催化反应逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｃａｔｅｃｈｏｌ－Ｏ－ｍｅｔｈｙｈｒａｎｓｆｅｒａｓｅ邋ｃａｔａｌｙｔｉｃ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ逡逑0－甲基转移酶在生物合成途径中广泛存在

ｒｏ，ｊ0邋＋邋ＸＸｊ逡逑Ｈ逦Ｕ逡逑图１＿５褪黑素化学合成途径逡逑Ｆｉｇ．邋１－５邋Ｍｅｌａｔｏｎｉｎ邋ｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋ｐａｔｈｗａｙ逡逑注：Ａ为丙二酸二乙酯和丙烯腈为原料的合成途径；Ｂ为１

【参考文献】

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1 万艳娟;吴军林;吴清平;;辅酶Q_(10)生理功能及应用研究进展[J];食品工业科技;2014年14期

2 王华美;于延冲;付春祥;周功克;高欢欢;;木质素合成关键酶咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶的研究进展[J];基因组学与应用生物学;2014年02期

3 陈单丹;岑沛霖;刘文;徐志南;;大环内酯类免疫抑制剂他克莫司的生物合成机制研究进展[J];有机化学;2013年06期

4 郑立稳;高永超;张强;邱维忠;王加宁;迟建国;;香兰素的化学合成方法研究[J];化工时刊;2012年06期

5 张传丽;仲月明;沈丹红;陈鹏;;植物类黄酮O-甲基转移酶研究进展[J];西北植物学报;2012年06期

6 王雪;梁建友;李瑞;;水杨酸甲酯生产工艺的研究进展[J];化工时刊;2009年04期

7 舒婷;李光兴;;碳酸二甲酯作甲基化试剂的研究进展[J];化工中间体;2008年01期

8 田铃;嵇保中;刘曙雯;金凤;高洁;;甲基转移酶的功能与分类[J];生命的化学;2007年05期

9 李付鸾;谢忠平;;儿茶酚胺氧位甲基转移酶的克隆表达及纯化[J];中国生化药物杂志;2007年01期

10 孔宪明;宫红;姜恒;李秀琴;张溪波;;2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮的合成及工业放大试验[J];精细化工;2006年07期

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2 朱玉威;氧—甲基转移酶Ubig和蓖麻毒素A链与抗体6C2复合物的结构生物学研究[D];中国科学技术大学;2014年

3 马成英;茶树O-甲基转移酶基因克隆及其对类黄酮催化特异性的研究[D];中国农业科学院;2013年

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2 吴慧;儿茶酚胺氧位甲基转移酶Val158Met基因多态性在中国人群中帕金森病剂末现象易感性的研究[D];上海交通大学;2015年

3 刘德福;新型酰化和甲基化反应探索[D];苏州大学;2015年

4 王宁;碳酸二甲酯的绿色工艺开发[D];青岛科技大学;2012年

5 蔡安安;褪黑素的绿色合成方法研究[D];长沙理工大学;2011年

本文编号：2830527