赤芝多糖结构和构象表征及其免疫调节构效关系研究

发布时间：2020-10-09 20:25

　　珍稀药用真菌灵芝在功能食品和药品领域应用广泛,多糖是其最主要的活性成分之一,在抗肿瘤、调节机体免疫等方面效果显著。但由于多糖结构的复杂性以及灵芝原料的多样性和纯化技术上的差异,导致其分子结构尚未完全探明,更缺乏灵芝多糖的构效关系研究。本论文以赤芝子实体多糖为研究对象,对其进行分离纯化并系统表征其结构单元和构象特征;结合体内外免疫调节活性评价,阐释其构效关系;在此基础上开发针对活性多糖的制备技术和检测方法,为此类成分的进一步应用及质控奠定基础。本研究首先比较了中国药典收录的灵芝即赤芝和紫芝子实体多糖的分子量分布特征和单糖组成,揭示了赤芝和紫芝在大分子量多糖(M_w1×10~6 g/mol)成分上的差异,并明确了赤芝多糖的分子量分布与其菌株遗传特性间的非相关性;不同菌株赤芝子实体粗多糖的单糖组成相似,均主要由氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖及葡萄糖醛酸组成;单糖比例上存在差异,其中葡萄糖占比最高。通过优化获得低浓度乙醇沉淀法纯化多糖的工艺,制备得到均一多糖组分GLP20,HPSEC-MALLS-RI分析其重均分子量为2.42×10~6 g/mol,多分散系数为1.32,苯酚硫酸法测定其糖含量为95.9%。通过单糖组成、甲基化及NMR分析,明确了赤芝大分子多糖组分GLP20的一级结构单元,是以β-1,3-糖苷键连接为主链、β-1,6-糖苷键连接为支链的葡聚糖,其支链与主链的比为1:3。应用激光光散射和HPSEC-MALLS-RI-VS联用分析,对该多糖在溶液中的构象特征进行了系统表征。证明其在水溶液体系中呈现三股螺旋构象,在温度不超过135℃范围内构象稳定;该多糖在DMSO和浓度大于0.15 M的NaOH溶液中出现构象转变。流变学特性分析显示,GLP20水溶液呈剪切变稀非牛顿流体,在一定浓度和温度下可形成弱胶体;GLP20多糖的成胶机理与香菇多糖相似,为高度缠结的三螺旋链形成连续的网络从而导致多糖溶液的凝胶化,不存在交联点及明显聚集体,且GLP20凝胶具有热力学可逆性,这些特性与GLP20的高级构象特征相关。为了阐释赤芝β-葡聚糖在免疫调节功能上的构效关系,本研究通过超声降解得到结构单元相同但分子量范围在3.5×10~4-2.42×10~6 g/mol的系列组分,并通过硫酸化修饰得到系列取代度和分子量大小不同的衍生物;系统比较了β-葡聚糖分子量及结构修饰对其增强免疫和抗炎活性的影响。体内外活性比较结果显示,分子量大于1.80×10~6 g/mol的两个多糖组分表现出较好的提高免疫活性,分子量为3.5×10~4 g/mol的低分子量组分表现出更好的抗炎功效。硫酸化修饰可以改变赤芝β-葡聚糖的分子量和构象特征,并可以增强其抗炎活性。抗炎活性与硫酸基取代度和衍生物的分子量相关,取代度较高的组分抗炎活性较好;在取代度相近时,重均分子量较大的组分活性较好。为给高纯度灵芝活性多糖的生产提供方法学依据,本研究基于GLP20的结构和构象特征,建立了赤芝大分子β-葡聚糖的HPSEC-MALLS-RI联用检测分析方法,用于赤芝子实体原料的优选和质控,并获得富含此多糖的优质子实体原料,其大分子量活性多糖含量达到8.2 mg/g,远高于其他赤芝菌株子实体。通过比较酶法试剂盒检测法和苯胺蓝荧光检测法对不同结构多糖中β-葡聚糖含量的测定效果,明确了苯胺蓝荧光法检测β-1,3-葡聚糖专一性好。为提高β-葡聚糖的提取效率,本研究比较了不同溶剂对赤芝β-葡聚糖的提取得率,结果显示KOH碱溶液提取得率较高,说明赤芝β-葡聚糖主要存在于细胞壁上。通过超微粉碎预处理结合水提低浓度醇沉,大大提高了赤芝β-葡聚糖的提取得率和纯度,可用于赤芝β-葡聚糖的高效制备。
【学位单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：O629.1
【部分图文】：

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灵芝多糖还有多种功效，如通过显著降低自由基或平等来发挥抗氧化作用[83]；通过拮抗自由基引起的损伤、抑制脂制谷丙转氨酶的活力等来发挥保护肝脏的作用[11]。此外，灵芝多解疲劳等方面，也有很好的效果[11]。说，灵芝多糖因其结构的复杂性，使其药理活性广泛，具有重要，在各领域活性作用机制的探索也成为研究热点。的构象研究方法物大分子，多糖的结构非常复杂，可以分成四个层次[84]，即一级构（链之间以氢键的结合而形成的聚合体）、三级结构（空间呈构（链之间以非共价键的结合而形成的聚集体）。多糖的初级结构象，对其生物活性有重要影响。对灵芝多糖而言，一级结构报究相对较少。糖在单糖组成、连接基团及连接方式上的差异，使得其分子在溶。多糖在不同溶剂体系中存在的可能的构象如图 2 所示[85]，主要旋状链（单股、双股、三股）、蠕虫状、棒状和聚合体等等。

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图 2-2 多糖分离纯化流程图 Protocol for the separation and purification of polysaccharide 比较细胞释放 NO 的模型，用于比较不同品种赤芝子实9]的方法，将样品配制成系列浓度备用；培养 RAW2胰酶消化后，180 ×g 离心 3 min 收集细胞，按照细胞共培养 48 h。然后取上清，利用 Griess 试剂法PBS 和细菌脂多糖（LPS，1 μg/mL）分别做阴性对照分子量和纯度测定后的乙醇浓度对赤芝提取物进行沉淀，并经过 2 次编号为 GLP20。以硫酸-苯酚法测定赤芝多糖的糖含S-RI 系统鉴定赤芝多糖的纯度，并分析计算其分子LLS-RI 系统定量分析赤芝大分子量活性多糖含量绘制GLP20）作为标准品并配制成0.25 mg/mL、0.5 mg/m

灵芝子实体,紫芝,灵芝,子实体多糖

21C 分析几种主要灵芝子实体中多糖分子量分布。GL(WF)：龙芝 2 号灵芝 1 号；GS：紫芝EC profiles of polysaccharides from the fruiting bodies of Ganoderma spidum Longzhi No. 2‖; GL(HN): G. lucidum Hunong No. 1‖; GS: G. siALLS-RI 分析结果显示，赤芝和紫芝的多糖分子量分布特 2 号和沪农灵芝 1 号的子实体多糖分布特征相似，均含有只含有两个峰，出峰时间最早的峰1在紫芝子实体中没有检明显的示差信号，又有明显的紫外检测信号，所以认为此部经检测，峰 3 为分子量为 1×104-1×105g/mol 范围内的混合分子量进行计算，结果如表 2-2 所示。

【参考文献】