质谱联用新技术在低分子肝素药物质量控制方面的应用

发布时间：2020-10-22 03:15

　　 肝素是一种由重复的二糖单元组成的具有多分散性的线性多糖,因其具有和抗凝血酶Ⅲ特异性结合的序列而具有促进抗凝血活性的生物功能,20世纪30年代开始肝素被应用于临床上对静脉血栓、肺栓塞和深静脉栓塞的治疗。如今的肝素大部分从猪小肠粘膜中提取,继2008年的肝素钠危机后,出于对单一的肝素生物来源安全性的担忧,美国药典委员会在2015年召开了肝素表征研讨会,讨论了将牛肝素重新引入肝素市场的可能。因近十年疯牛病疫情逐渐被控制,美国食品药品管理局也成立了牛肝素工作小组,这一举动带动了科研单位对牛肝素的研究。低分子肝素是由未分级肝素经过降解后制备得到的一类分子量更小的抗凝血药物,相比肝素,低分子肝素的抗凝性质更可控,半衰期较长,生物有效性更高。根据降解方法的不同,低分子肝素可以分为以下几类,化学β-消除裂解法制备的依诺肝素钠,化学脱氨基裂解法制备的达肝素钠和那屈肝素钙,酶解β-消除裂解法制备的汀肝素钠和自由基氧化裂解法制备的帕肝素钠。因低分子肝素具有更优良的性质,被用于制备低分子肝素的未分级肝素占到了其总量的60%,依诺肝素钠是被应用最广泛的低分子肝素药物,在美国市场中可以占到70%的市场份额。世界卫生组织通过建立标准体系规范并统一了肝素和低分子肝素药物的活性单位,各国药典也根据世界卫生组织的要求在本国药典中对肝素和低分子肝素的活性和结构提出了具体的要求,并相应的提供药物表征的指导方法。在2010年,美国食品药品管理局批准了第一批依诺肝素钠仿制药,提出了保证仿制药和其原研产品等同性的五个标准,即理化性质等同,原料和降解工艺等同,二糖组成、糖片段指纹图谱和寡糖序列等同,生物和生化指标等同,药效学性质等同。同年中国国家食品药品监督管理总局药品审评中心也对低分子肝素的分类报批提出建议,并在2014年发表文章,提出了低分子肝素类药物结构确证的研究思路,包括单糖组成、二糖谱、寡糖片段分布和寡糖序列以及末端结构等。此外,不同生物来源的肝素药品之间结构和活性具有差异,而低分子肝素来源于未分级肝素,其结构与其母本肝素具有很高的相关性,基于活性五糖序列结构的抗凝活性因此也高度相关,因此对低分子肝素和其母本肝素之间的构效关系研究对低分子肝素的质量评估也有重要作用。质谱是一种可以和多种分离方法联用的分析方法,可以实现高灵敏度、高分辨率和高特异性,高效液相色谱-质谱联用和毛细管电泳-质谱联用方法已经被充分开发出来,用于低分子肝素的结构表征。核磁共振波谱法具有相对较低的灵敏度,但其分辨率极高,并且可以解析糖苷键类型,分辨同分异构体,识别杂质组分,因此也被广泛地用于低分子肝素结构表征。针对美国食品药品管理局和中国国家食品药品监督管理总局药品审评中心对低分子肝素结构确证的要求和建议,低分子肝素的结构表征可以大致总结为两种策略,即Top-down和Bottom-up。与蛋白质组学分析策略类似,低分子肝素的Top-down分析策略即不对样品进行前处理,直接进行分析的策略,在常规的低分子肝素结构表征中主要包括以下几种,使用凝胶排阻色谱测定低分子肝素相对分子质量及分布,使用液质联用法分析低分子肝素完整糖链指纹图谱,使用核磁共振波谱法分析低分子肝素的糖醛酸组成和糖胺取代情况,以及使用二级质谱法测定低分子肝素糖链序列。Bottom-up分析策略需要将低分子肝素糖链进行降解,而后对其二糖组成或寡糖组成进行结构表征,再进一步推测样品完整结构信息。主要包括通过高效液相色谱法、毛细管电泳法、液质联用法等测定低分子肝素的完全酶解产物的二糖组成,或通过上述分析方法分析低分子肝素部分酶解的寡糖组成等。本论文通过结合多种目前被广泛应用的Top-down分析方法和Bottom-up分析方法建立了一套全面表征低分子肝素药物的分析策略,其中Top-down方法包括以亲水相互作用色谱-质谱联用为基础的完整糖链指纹图谱分析和以核磁共振波谱为基础的单糖组成分析,Bottom-up方法包括以离子对反相色谱-质谱联用为基础的二糖分析和以亲水相互作用色谱-质谱联用为基础的寡糖组分分析。进一步应用该全面分析策略,进行了三个层次的研究:①比较了市售低分子肝素之间的相似性,并探讨低分子肝素结构相似性的标准;②探究了以牛小肠肝素和牛肺肝素为母本,应用化学β消除裂解工艺制备的两种低分子肝素与依诺肝素钠原研药之间的构效差异,并探讨了低分子肝素和母本之间的联系;③全面评估六对来源于不同低分子肝素生产企业的未分级肝素和以其为母本的低分子肝素的结构关系,并通过主成分分析得到母本肝素和低分子肝素之间的联系和差异。此外,本论文还开发了一种更有利于低分子肝素质谱检测的负离子模式下的毛细管电泳-质谱联用方法,并成功地分别应用Top-down和Bottom-up分析策略测定了依诺肝素钠的完整糖链组成和寡糖组成。本论文的主要研究成果如下:1.建立了综合的Top-down和Bottom-up分析策略我们综合了 Top-down和Bottom-up的分析策略,应用HILIC-MS方法测定了依诺肝素钠完整糖链的组成和分布,同时用酶解法处理样品,通过RPIP-MS和HILIC-MS分别检测了其二糖组成和寡糖组成,并最终用NMR检测了不同种类的糖醛酸在低分子肝素中的含量,建立了一套全面的依诺肝素钠评估体系。通过比较4种市售依诺肝素钠注射液可以发现,来源于同一个生产厂家的原研药Lovenox(?)和Clexane(?)具有很小的批次间差异,由Sandoz和Teva生产的依诺肝素钠仿制药与原研药注射液具有相似的结构特征,在糖链的相对含量上也类似。在Clexane(?)和Lovenox(?)中也可以观察到大于系统误差的批次间差异,两种原研药之间的差异说明,相同的依诺肝素钠产品的糖链组成可以在一定范围内有浮动。2.应用综合分析策略比较了两种牛低分子肝素应用综合分析策略,我们比较了以牛小肠肝素和牛肺肝素为母本,应用化学β-消除裂解工艺制备的两种低分子肝素与依诺肝素钠原研药Lovenox(?)之间的构效差异,并探讨了低分子肝素和母本之间的联系。在结构表征实验中,两种牛低分子肝素均被检测到和Lovenox(?)具有一定的可比性。在活性测试中,尽管两种牛肝素的效能都低于猪小肠肝素,而由这两种肝素裂解产生的依诺肝素钠却与Lovenox(?)具有类似的抗Ⅱa因子和抗Xa因子效价。因此,虽然牛的未分级肝素相比猪肝素会有一些结构和功能上的不同,但这些差异在其降解后的产物——低分子肝素中间会成为微小差异,因此由牛或者猪的未分级肝素经不同的工艺裂解得到的产品可能都会具有一定的可比性。此外,在实验中我们发现,在单糖组成和寡糖组成上,低分子肝素倾向于表现出和其母本肝素相似的组成特征。3.应用了综合分析策略得到低分子肝素和其母本肝素的关联性本部分的研究中,除了应用Top-down和Bottom-up分析方法全面评估六对来源于不同低分子肝素生产企业的未分级肝素和以其为母本的低分子肝素的结构关系外,我们应用了一种新的生物信息学软件GlycCompSoft,并重点关注了如何通过数据分析手段获得传统的数据呈现方式所不能呈现出来的差异信息。主成分分析法成功地得到了肝素和以其为母本的低分子肝素之间的结构联系,并成功地区分了不同的生产厂家之间的低分子肝素产品。本研究拓展了主成分分析在药物评估领域的应用,确认了其对放大相似产品之间的差异具有明显作用,可以用于匹配未知信息的肝素母本和低分子肝素产品。4.建立了一种负离子模式下分析低分子肝素的CE-MS方法我们开发了一种新的毛细管电泳-质谱法对肝素二糖、磺达肝癸钠、低分子肝素酶解产物和低分子肝素完整糖链进行分析,并得出结论,通过在背景电解液种添加甲醇和使用蛋白质图层的鞘流管,可以将毛细管电泳和质谱在负离子模式下联用,进而分析肝素及低分子肝素这一类更容易带负电荷的酸性分子。通过本毛细管电泳-质谱法采集得到的分析结果与亲水相互作用色谱-质谱分析的结果类似,却拥有更简便的实验操作和更短的分析周期。相比之前发表的正离子模式毛细管电泳-质谱法分析肝素寡糖,负离子模式下的毛细管电泳-质谱法使得进一步的二级质谱测序低分子肝素成为可能。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TQ464;O657.63
【部分图文】：

其关注了肝素药品储备、来源和污染方面可能存在的风险。ＦＤＡ在２０１６年成立??了牛肝素工作小组，这些举动带动了科研单位对牛肝素研究的复苏［１６，１７］，同时对??羊肝素的表征也逐渐展开［｜８〗。美国市场上药用肝素的发展历史如

质酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ?ａｃｉｄ，ＨＡ）在生物体内共同属于糖胺聚糖（Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ，??ＧＡＧｓ）家族。肝素的生物合成在肥大细胞的高尔基体进行，包括起始、延伸和??修饰三步，如图１．３所示。起始步骤即为连接域（Ｌｉｎｋａｇｅ?ｒｅｇｉｏｎ）四糖的合成：??４??

ＧｌｃＮＳ’１］。此外，少数结构也在研究中被观察到，例如带有２－０－Ｓ的ＧｌｃＡ，带??有?３－（９－Ｓ?的?ＧｌｃＮＡｃ?和游离氧基葡萄糖胺（Ｆｒｅｅ?ａｍｉｎｅ?ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ，Ｇ１ｃＮＨ２）［３２１。??在总结前人工作的基础上，今天我们理解的肝素化学结构如图１．４所示。其??相对分子量在５，０００－４０，０００?Ｄａ之间分布，大多数组分的分子量在１２，０００－２５，０００??Ｄａ之间，是由重复的二糖单元组成的线性多糖。肝素二糖单元内部ＨｅｘＡ和ＧｌｃＮ??之间由（３－１，４糖苷键连接组成，二糖单元之间由ａ－ｌ，４糖苷键连接。ＨｅｘＡ主要为??ｐ－Ｄ－ＧｌｃＡ和ａ－Ｌ－ＩｄｏＡ，其中ＩｄｏＡ的Ｃ２可能发生２－０－Ｓ修饰。ＧｌｃＮ主要为ａ－Ｄ－??ＧｌｃＮＡｃ、ｔｘ－Ｄ－ＧｌｃＮＳ
【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 张震;;低分子肝素的结构确证研究[J];中国新药杂志;2014年08期

本文编号：2851017