基于超临界流体色谱技术的海风藤化学成分分离分析研究

发布时间：2020-10-25 07:17

　　 超临界流体色谱(supercritical fluid chromatography,SFC)具有高效快速、绿色环保的优点,在天然产物的分离中得到了关注。海风藤是一种富含木脂素、生物碱等成分的藤类药物,其物质基础的研究是更好发挥临床应用的基础。本文以海风藤为研究对象,基于SFC建立快速二维色谱方法,基于手性SFC分离纯化木脂素结构类似物,结合SFC和反相液相色谱(reversed-phase liquid chromatography,RPLC)建立海风藤总体分离方案,评价SFC烷基和苯基固定相,探索SFC分离机理。此系列工作为拓展SFC在天然产物分离分析中的应用奠定基础,也为解决天然产物的分离难题提供技术支持。论文首先建立了 2D RPLC/UHPSFC(ultra high performance supercritical fluid chromatography)方法,对海风藤石油醚(petroleum ether,PE)部位和乙酸乙酯(ethyl acetate,EA)部位进行快速分析。PE和EA部位经RPLC分离分别得到21个组分和28个组分。SFC经条件优化后,可使PE各组分均在2 min内完成分离,EA各组分均在3 min内完成分离,且分离效果良好,充分体现了 SFC快速高效的特点。同时UHPSFC还表现出与RPLC的高度正交性,PE部位和EA部位经63 min和112 min的分析(每次分离包括1 min的平衡时间),分别检测到204个和829个色谱峰。通过该二维体系的分析也更深入地认识到海风藤化学组成的复杂性。论文采用手性SFC用于解决4个木脂素非对映异构体的分离。在CSP-1色谱柱上的分离采用自动连续叠加进样方式,每个循环进样4次,用时32.5 min,经过2次循环可分离710 mg样品,得到组分1(化合物1和2)和组分2(化合物3和4)。采用CSP-2色谱柱同样以自动叠加进样方式,组分1在37 min内,通过14次进样分离得到103.1 mg化合物1和10.0 mg化合物2,组分2在35 min内,通过10次进样分离得到152.3 mg化合物3和178.6 mg化合物4。手性SFC是解决结构类似物分离的有效手段,且不同的手性柱可提供不同的分离选择性,在天然产物分离中具有很好的应用前景。在以上工作的基础上,建立了四个层次的分离策略用于海风藤的系统分离。前两个层次的分离主要是利用SFC高效快速,有机溶剂用量少,后处理简单方便的优势,在SFC上实现样品的快速简化,以解决液相色谱分离中峰容量不足的问题。在SFC的分离主要关注分离稳定性、载样量,制备效率和收集方式;第三层次是利用SFC与RPLC正交性好的优势,通过制备RPLC进行单体化合物的纯化,因此更关注分离选择性问题。第四层次采用手性SFC以解决难分物质的分离问题。以第一次SFC分离的一个组分为示范,采用此分离策略制备得到28个化合物,其中包含5个新化合物。制备SFC成功解决了这种多层次制备中的效率问题,此系统分离方案针对性地解决了复杂样品分离的难点问题。论文建立了不同键合密度的5种C8固定相和2种苯基固定相的LESR(linear solvation energy relationship,LSER)模型。模型参数定量地说明疏水作用随着键合密度的增加而增加,改性剂的种类和比例对各种作用力也有影响。向量夹角的评价说明C8与硅胶固定相的正交性随着键合密度增加而变大,不同键合密度的C8固定相,以及苯基与高键合量C8都有一定的正交性,而且高比例改性剂有利于提高分离选择性。固定相的log k-log k图说明化合物如果能和固定相产生多种作用力有利于调节分离选择性。用硅胶和以上7种固定相分离8个酰胺类生物碱,在硅胶柱上保留更好,C8和苯基分离选择性更好,可以分离不同饱合碳链长度、双键数目,顺反异构的生物碱。论文采用了 SFC技术,解决海风藤快速分析、结构类似物分离以及系统分离的问题,并且评价和拓展非极性固定相在SFC中的应用。论文以SFC为技术手段,开展了海风藤化学成分分离的系统研究工作,对SFC的分离机理、保留规律以及海风藤的化学组成都有了更加深入的认识。
【学位单位】：华东理工大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TQ464;O652.63
【部分图文】：

［８１］。由于流动相中较少使用水，和水－有机体系比较，化合物和固定相之间的作用更加??突出［７１］。如图１．７所示，采用纯Ｃ０２做流动相的ＳＦＣ更接近正相色谱，而加入极性改??性剂后采用烷基键合固定相，可以模拟反相色谱，加入水做改性剂后可以模拟离子交换??色谱等。因此适当的改变操作条件可以使ＳＦＣ具有十分广泛的应用。??Ａｌｃｏｈｏｌｓ?Ａｃｉｄｓ?Ｉｎｏｒｓａｎｌｃ?ｉｏｎｓ??Ｅｔｈｅｒｓ?Ａｎｉｌｉｎｅｓ?Ｐｒｉｍａｒｙ?ａｌｉｐｈａｔｉｃ?Ｌａｒｇｅ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ??Ｐｅｎｔａｎｅ?Ｅｓｔｅｒｓ?Ａｍｉｄｅｓ?ａｍｉｎｅｓ?Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｓ?Ｐｅｐｔｉｄｅｓ?ＤＮＡ／ＲＮＡ??ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ?ｐｏｆａｒｒｔｙ??????；?Ｉ??’?．；！??ｉ?．．．．．?Ｊ?！??：．．．．．．．．．．．．．．．；．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．丨??：?ｍｍｉｕ?ｔ?ｊ?ｐｊ＇ｉｉｍＨｉｉ?；??；?；?？ｕ？！ｉｉｍ｛ｒｍ－．．?：??图１．７使用添加剂和改性剂的ＳＦＣ应用范围［７１１??Ｆｉｇ．?１．７?Ｔｈｅ?ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ?ｒａｎｇｅ?ｏｆ?ＳＦＣ?ｗｉｔｈ?ｃｏ－ｓｏｌｖｅｎｔｓ?ａｎｄ?ａｄｄｉｔｉｖｅｓ１７１］??最后，ＳＦＣ的检测有很多方法：当使用纯Ｃ０２时，可以使用火焰离子化或者红外检??测器；当?Ｃ０２?中加入改性剂，可以使用?ＵＶ，?ＥＬＳＤ，?ＭＳ，?ＣＡＤ（ｃｈａｒｇｅｄ?ａｅｒｏｓｏｌ?ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ），??或者ＡＦＤ（ａｃｏｕｓｔｉｃ?ｆｌａｍｅ?ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）。如果拆分手性物质

质之间的相互关系，在色谱上常用保留因子的对数（ｌｏｇ?ｋ）表示。字母Ｅ，?Ｓ，?Ａ，Ｂ和??Ｖ是对溶质分子的描述，每一个描述符都表示特定分子之间的相互作用。小写的字母表??示模型的系数或者系统常量，各个系数表示的意义如图１．８所示。??ｌｏｇ?／ｒ?＝?ｃ?＋?ｅＥ?＋?＋?＋５Ｓ?＋??Ｉ?／?／??ｉ?＼＼ｗ＼＼＼＼＼??ｉ?Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ?ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ??Ｃａｖｉｔｙ?ｅｆｆｅｃｔ??ｖｗｗｗｗ?／?＾?－??Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ?ｒｅｌａｔｅｄ?ｔｏ?ｎ／ｎ?ｅｌｅｃｔｒｏｎｓ??ｎ?＼＼ｗｗ＼＼＼??＼＼＼＼＼＼＼＼＼?ａｃｉｄｏ－ｂａｓｉｃ??ｄｉｐｏｌｅ－ｄｉｐｏｌｅ?ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ?／?ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ??Ｈ??＼＼＼＼＼＼＼＼＼?－??图１．８?ＬＳＥＲ模型中相互作用图示??Ｆｉｇ．?１．８?Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ?ｍｅａｓｕｒｅｄ?ｂｙ?ｔｈｅ?ＬＳＥＲ?ｓｔｕｄｙ??其中Ｅ是过剩摩尔折射率（从分子的折射率计算）和表达从Ｔｔ到ｎ电子极化率的贡??献（电荷转移作用和色散力作用）；Ｓ是偶极和极化率（偶极一偶极、偶极一诱导偶极??作用力）；Ａ和Ｂ分别表示溶质形成氢键能力包括酸度（给电子能力）和碱度（接受电??子能力）；Ｖ表７Ｆ麦高文（ＭｃＧｏＷａｎ）特征体积（表征化合物的分子体积的大小，描述??色散作用力）。因此，ＬＳＥＲ可以从分子水平上将溶质的理化性质和体系不同类型的溶质??－溶剂

碳和改性剂的比例在进样前后保持一致。Ｌａｒｒｙ?Ｍｉｌｌｅｉ？等［１２４Ｈ羊细考察了这两种进样方式??对峰形的影响，如图Ｕ５所示，在相同进样质量情况下，考察不同进样体积和进样方式??的影响。图１．１５?Ａ－Ｄ为混合改性剂进样，随着进样体积逐渐増加（从０．６３?ｍＬ到５?ｍＬ），??可以看到峰逐渐变形展宽，分离度下降。图１．１５Ｅ为改性剂进样，其进样体积与图１．１５Ｄ??一样都为５ｍＬ，但是明显看到图１．１５Ｅ的峰形和分离度远远好于图１．１５Ｄ。因此在制备??色谱上改性剂进样方式被大量采用，以避免峰形失真，特别是保证了在大进样情况下峰??形可以得到有效的控制。??
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本文编号：2855643