交联籽晶的制备及其影响蛋白质结晶的研究

发布时间：2020-10-25 08:27

　　 目前,从高纯蛋白质到获得适于结构解析的蛋白质晶体的成功率不到20%。因而,探求新的促进蛋白质形核的方法迫在眉睫。蛋白质晶体形核的方式主要分为均质形核法和异质形核法。在亚稳区,蛋白质通常不能通过均质形核结晶,但可以利用修饰过的界面材料或固体颗粒作为形核剂可以诱导蛋白质在亚稳区形核,进而获得适于衍射的晶体。与形核剂类似,晶种在促进蛋白质结晶方面也发挥着重要作用,本文提出利用交联晶体作为晶种诱导蛋白质结晶。交联蛋白质晶体是利用交联剂化学交联的蛋白质晶体,不溶于水和有机溶剂。交联蛋白质晶体具有优越的机械、化学和热稳定性。此外,交联蛋白质晶体具有三维有序的结构,它们的衍射谱图与自然生长的晶体高度一致。综上分析,交联蛋白质晶体可能是一种非常理想的诱导蛋白质结晶的材料,本文初步探讨了交联籽晶在蛋白质结晶中的效果。本文首先研究了高质量交联蛋白质晶体的制备方法。天然生长的蛋白质晶体只能在结晶母液中保持完整的结构,一旦脱离母液会很快开裂并溶解。利用交联剂对蛋白质晶体进行化学交联,可以有效地把蛋白质分子限制在晶格内,从而解决晶体稳定性的问题。然而,利用交联剂处理蛋白质晶体通常面对一个问题,即交联会引起蛋白质晶体开裂。为了解决这个问题,本文通过正交实验研究了多种因素(结晶生长时间、温度、交联时间、溶液pH和戊二醛浓度)对交联蛋白质晶体开裂的影响,以获得交联蛋白质晶体的最佳制备条件。目前,蛋白质晶体与戊二醛之间的交联交联机理尚不清楚。晶体与戊二醛的交联是一个自外而内的过程,外部的蛋白质分子优先与戊二醛分子反应,随后与内部的蛋白质分子交联,因而晶体内外的交联并不完全均匀。本论文选用不同的交联时间(12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、84 h和108 h)分析了不同交联程度的溶菌酶晶体质量的差异。通过分析晶体的分辨率、镶嵌度、B因子和晶格常数等,进一步解释戊二醛和蛋白质晶体之间的交联机理。在获得高质量交联蛋白质晶体后,便可以利用交联晶体作为籽晶诱导目标蛋白质结晶,主要开展了以下工作:(1)研究了交联籽晶技术对蛋白质结晶可重复性的影响,发现交联籽晶可以提高溶菌酶结晶的可重复性,并且蛋白质浓度越低,提高幅度越明显;(2)研究了交联籽晶对蛋白质结晶条件筛选的影响,结果发现交联籽晶可以显著提高蛋白质的筛选成功率,并且交联籽晶对同种蛋白质的筛选效果最好;(3)研究了交联籽晶对蛋白质晶体质量的影响,结果发现添加交联籽晶不仅可以显著改善蛋白质晶体的形貌,还可以提高蛋白质晶体的质量。综上,本论文通过正交实验系统研究了影响交联蛋白质晶体开裂的各种因素,提出了制备交联溶菌酶晶体的最佳交联条件。通过制备不同交联时间的蛋白质晶体,深入探索了戊二醛和蛋白质晶体交联的机理。最后,利用交联蛋白质晶体作为籽晶,开展了蛋白质结晶筛选和晶体质量的研究,为制备高质量的蛋白质晶体提供一种新的方法。
【学位单位】：西北工业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：O629.73
【部分图文】：

图 1-1 溶菌酶晶体在平行和垂直磁场下的定向。a-a’’代表 pH = 4.60，b-b’’代表 pH = 5.50，H 代表磁场强度。磁场强度为 10 T[25]Fig. 1-1 Clarification of the orientation responses of lysozyme crystals to the magnetic field using bothhorizontal and vertical magnetic fields. a-a’’represents pH 4.60; b-b’’representst pH 5.50; H: represents thdirection of magnetic field. The magnetic field was 10 T[25]

图 1-2 交联蛋白质晶体制备示意图[43]Fig. 1-2 A schematic illustration of the preparation process for CLPCs[43]第二步是蛋白质晶体的化学交联。常用的交联剂可分为三类：同双功能交联剂功能交联剂和光敏交联剂。其中，同双功能交联剂有两个相同的活化反应基团[44]

系统研究了交联籽晶对蛋白质结晶筛选和晶体质量的影响。本论文的技术路线如图1-3 所示。图 1-3 本论文的实验技术路线Fig. 1-3 The experimental route of the paper本论文的研究主要包括以下几个方面：（1）戊二醛交联溶菌酶晶体的工艺探讨。设计了一个五因素（温度、溶液 pH、晶体生长时间、戊二醛浓度和交联时间）四水平的正交实验以研究交联溶菌酶晶体的开裂
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本文编号：2855702