重组解脂亚罗酵母合成菜油甾醇的研究

发布时间：2020-10-30 04:20

　　 植物甾醇是一种重要的具有生理活性的固醇类化合物,具有降低血液中胆固醇浓度、抗癌、抗氧化、类激素等作用,植物甾醇及其衍生物被广泛用于保健食品、药品以及化妆品中。酵母中麦角固醇的含量较高,麦角固醇与植物甾醇具有相似的化学结构,其生物合成途径中有植物甾醇合成的前体物质麦角-5,7-二烯醇,因此通过基因工程的手段改造麦角固醇合成途径合成植物甾醇成为可能。本研究建立了一种用GC-MS/SIM检测微生物中甾醇类化合物的方法;并以解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica polf)为宿主,构建了一株产菜油甾醇的菌株YL-PE,鉴别了其发酵产物,考察了菜油甾醇的合成量。Y.lipolytica是一种产油微生物,胞内油脂能为甾醇类物质提供存储空间,缓解过量甾醇累积对细胞膜流动性造成的影响,同时,胞内油脂的合成与菜油甾醇又共用乙酰CoA等前体物质,因此,细胞中油脂对菜油甾醇的合成既有促进又有竞争作用。如何充分利用油脂对甾醇合成的有利因素,是进一步提高甾醇积累量的基础理论问题。本研究在不同油脂产量的菌株中构建了菜油甾醇的合成途径,研究了油脂产量与菜油甾醇积累之间的关系,并构建转化DHCR7的多拷贝质粒进一步提高了菜油甾醇的产量,发酵罐发酵考察了最优菌株中菜油甾醇的产量,取得的主要研究结果如下:(1)以甾醇混合标样与Y.lipolytica polf发酵液样品为检测对象,建立了一种基于GC-MS/SIM检测微生物中甾醇类化合物的方法。此方法下各色谱峰之间分离度R均大于1.2;SIM模式下各待测组分在3-200μg/mL之间具有较好的线性关系,各组分的检出限大于5.0 μg/mL;精密度、稳定性和加标回收率结果显示,此方法多次测定样品RSD为8.14%,48 h内样品之间的RSD为6.96%,不同梯度的加标回收率在80.69-91.41%之间。方法验证结果说明此方法具有较好的分离度、线性范围、重复性、稳定性和准确度,能满足检测酵母中甾醇类化合物的要求。(2)以Y.lipolyticapolf为宿主,敲除了麦角固醇合成途径中ERG5基因,表达了来自非洲爪蟾的DHCR7基因,构建了一株能合成菜油甾醇的解脂亚罗酵母菌株YL-PE。经过鉴定对照菌株po1f、po1f-ERG5-和重组菌株YL-PE发酵产物,发现敲除ERG5使麦角固醇的合成停留在麦角-5,7-二烯醇,并且对宿主的生长有抑制作用,表达DHCR7基因使麦角-5,7-二烯醇转化成菜油甾醇;重组菌株YL-PE摇瓶发酵得到菜油甾醇的产量为485 μg/g;在5 LBioflo发酵罐发酵菜油甾醇的最大产量为15.2 mg/L。(3)以三株不同油脂产量的菌株(po1f、po1f-mfe-、po1f-pex10--mfe-)为宿主,研究油脂对菜油甾醇合成量的影响,并进一步表达DHCR7多拷贝质粒提高菜油甾醇的积累。结果发现,三个油脂含量依次增高的菌株(po1f-mfe--ERG5-、po1f-ERG5-、po1f-pex10--mfe--ERG5-)中,菜油甾醇的合成量分别为 757.8、480 和 589.9μg/g。其中,po1f-mfe--ERG5-菌株中菜油甾醇的产量最高为757.8μg/g,其油脂含量最少(42.3 mg/g),因此,菜油甾醇产量与油脂积累量没有显现出直接的对应关系,可能是因为甾醇产量较小,并没有以酯化形式存储于油脂中,使油脂提高甾醇产量的作用未能充分体现。同时发现,敲除MFE的菌株中,菜油甾醇产量均高于对照菌株po1f-ERG5-,细胞可能通过提高菜油甾醇的合成参与细胞膜的修复,缓解敲除MFE带来的损伤。另外,增加DHCR7拷贝数提高了DHCR7和ERG4相对表达量,使得碳代谢更多的流向菜油甾醇,显著提高了菜油甾醇的合成量。多拷贝质粒表达菌株中po1f-pex10--mfe--ERG5-菜油甾醇的产量最高,可达1062 μg/g DCW,发酵罐发酵得到49.2 mg/L菜油甾醇。综上,本研究建立了一种用GC-MS/SIM法检测微生物中甾醇类化合物的方法,构建了合成菜油甾醇的菌株YL-PE,并发现通过敲除MFE基因、增加DHCR7拷贝数是提高生物合成菜油甾醇产量的有效途径,研究结果为利用重组酵母生产菜油甾醇奠定了应用基础。
【学位单位】：陕西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TQ929;O629.21
【部分图文】：

２．４．２方法专属性的考察??对甾醇的混合标准品在选定条件下分析得到甾醇混合标准品的总离子流图??（Ｔｏｔａｌｉｏｎｃｕｒｒｅｎｔ，?ＴＩＣ）如图２－１，由总离子流图可以看出，在当前选定的条件下??内标物胆甾烷醇、麦角固醇、菜油甾醇、豆甾醇和Ｐ谷甾醇峰形良好。各甾醇的质??谱图引入到ＮＩＳＴ谱库中检索，与标准质谱图的相似度均在９８％以上。各个组分的??保留时间及色谱峰之间的分离度见表２－１，除了麦角固醇和菜油甾醇的分离度为??１．２９，说明麦角固醇和菜油甾醇能基本分离，其余组分分离度均大于１．５，证明此??条件下可以检测此五种甾醇，并且有较好的分离度。??１２００００００?－?ｌ．?ｃｈｏｌｃｓｔａｎｏｌ??－?１?２．?ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ??１０００００００?－?３．?ｃａｍｐｅｓｔｅｒｏｌ??！４．?ｓｔｉｇｍａｓｔｃｒｏｌ??５．?ｐ?－ｓｉｔｏｓｔｅｒｏｌ??＾?ｅｕｕｕｕｕｕ?ｈ?Ｉ?５??气。２?３?ｆ?Ｉ??■?５！?Ｉ?Ｉ１??２００００００?－?｜｜?ｊｌ?Ｉ?丨Ｉ??Ａ?丨?ｉ?ｆｉ?１１?Ｉ?ｊｉ??＾＾??八．＿?＿???／＼Ｊ?＾－?－－—??〇?Ｉ?＜?Ｉ?■?Ｉ?■?？?■?？?■?Ｉ?■?Ｉ?■?Ｉ?■?Ｉ?■?Ｉ?■?Ｉ?？?？??１１?１２?１３?１４?１５?１６?１７?１８?１９?２０?２１??Ｒｅｌｅｔｉｏｎ?Ｔｉｍｅ?（ｍｉｎ）??图２－

．、在宿主菌Ｋ／少ｏ／：＾ｃａｐｏｌｆ中转入线性化之后的敲除载体在ＳＤ－ＵＲＡ上培养４天，接下来对敲除菌株提取基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ验证，对于得到的阳性菌株要去掉染色体上的ｍａｒｋｅｒ－Ｕｒａ３［９７］，具体流程见图２－１。??（１）利用ｐｌｏｘｐ－ｕｒａ３－ｌｏｘｐ为载体构建敲除质粒；??（２）将构建好的敲除质粒选择合适的酶切位点线性化，转入Ｘ／ｉｐｏ／ｙｒｉｃ；??（３）对ＳＤ－ｕｒａ平板上长出的菌落，挑取单菌落接种到２ｍＬＹＰＤ液体，于２８°Ｃ１８０ｒ／ｍｉｎ在摇床中培养２４ｈ，提取待验证菌株基因组ＤＮＡ，的引物进行ＰＣＲ分别扩增敲除基因的上下游，验证双交换的结果；??（４）验证目的基因成功敲除的菌株，转入ｐＪＮ４４－ｃｒｅ，此质粒中ｅｒｅ蛋ｕｒａ３基因两端上的ＬｏｘＰ位点，表达Ｃｒｅ就可以对Ｍａｒｋｅｒ－ｕｒａ３进行定向（５）利用ＰＣＲ扩增验证ｕｒａ３是否成功去除；??（６）将ｕｒａ３基因成功去除的菌株，连续在ＹＭ）培养基中传３－５代，中?ｐＪＮ４４－ｃｒｅ。??，ｌａｎｋ１ｔｔｎ

分别用?ＥＲＧ５－ＵＰ－Ｆ／ＥＲＧ５－ＵＰ－Ｒ，ＥＲＧ５－Ｄ０ＷＮ－Ｆ／?ＥＲＧ５－ＤＯＷＮ－Ｒ?ＰＣＲ?扩增??得到基因的上游序列７００ｂｐ，下游序列６７０ｂｐ。现Ｇ５敲除质粒的构建流程??图，如图３－３，首先将上游片段连接到质粒ｐＬｏｘｐ－ｕｒａ－ｌｏｘｐ上并转化至大肠杆菌，??挑取单菌落接种于含有Ａｍｐ的ＬＢ液体培养基中，２４?ｈ后提取质粒ｐＥＲＧ５－ｕｐ－??ｌｏｘｐ－ｕｒａ－ｌｏｘｐ。对质粒酶切验证，使用Ａｐａｌ，Ｘｂａｌ酶切后分别得到７０２ｂｐ，５０３５ｂｐ??的两个ＤＮＡ片段，如图３＊４。在验证正确的阳性质粒基础上，连接下游片段，得??到质粒?ｐＥＲＧ５－ｕｐ－ｌｏｘｐ－ｕｒａ－ｌｏｘｐ－ｄｏｗｎ，使用?Ｓｐｅｌ，?Ｎｄｅｌ?酶切后得到?６７７?ｂｐ，?５７０５??ｂｐ的两个ＤＮＡ片段，如图３＞４。至此，敲除质粒的上下游均验证正确，即得到??敲除质粒。??３８??
【参考文献】

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本文编号：2861980