增敏型电化学卡那霉素适体传感器的构建与性能研究

发布时间：2020-11-04 21:26

　　 近年来,随着全球兽药残留问题日趋严峻,各类新型检测技术得到了迅猛发展。在这些技术中,基于核酸适体的标记型电化学传感器表现出操作简单、无试剂化、可重复使用、在复杂基质中工作能力强且可与生物芯片相兼容等诸多优点,易于实现微型化和在线监测,与其他技术相比,通过基础功能参数性能的改良,将更有利于实际应用化,极具研究开发价值,是未来发展的重要方向之一。本文以核酸DNA适体-卡那霉素A(KMY-A)特异性作用体系为研究对象,通过探针自组装结构变化,定向设计并构建了三类分别基于单、双和三探针组合5种不同构型的电化学传感器,系统研究了构型变化对改善灵敏度的影响,成功实现了通过构型变化调控和有效提高传感器信号增益率(SE%)或绝对检测信号值(DS)和基础功能如检测限、响应速度和选择性等参数性能的目标。具体工作分述如下:一、基于目标物诱导构型变化信号机制构建了一种单探针体系传感器(S-1)。实验优化了探针密度、支持溶剂链长度、工作介质离子强度和检测温度4个影响传感器构建和工作效率的关键参数。在优化条件下,该传感器用于KMY-A检测,添加2.0 m M浓度下SE%为226.1±8.0%;线性范围为1.0μM~1.0m M,检测限为0.33μM;对其他5种非同类结构抗生素分子表现出较好的区分度,区分系数介于-0.002~0.019之间,对同类结构同系物卡那霉素B(KMY-B)表现出一定的区分度,区分系数为0.90;响应时间为~15 s,显示出超快的传感速度;用于三类目标物残留常见实际样品牛奶、自来水和血清的分析评价,SE%值分别为116.2±7.2、172.7±8.7和81.7±5.8,表现出较好的工作性能。二、针对S-1因捕获信号探针(CSP-MB)自由弹性摆动导致背景电流相对较高的缺点,通过引入支撑辅助探针(AP)设计并构建了基于目标物诱导取代反应信号机制的双探针体系传感器(S-2)。该传感器借助辅助双链作用有效限制了CSP的自由弹性摆动,从而降低背景电流,相对提高检测灵敏度。实验优化了AP和CSP的比例、混合探针浓度、AP/CSP双链位置和AP长度4个影响传感器构建和工作效率的关键参数。在优化条件下,该传感器用于KMY-A检测,添加2.0 m M浓度下SE%为502.1±26.0%;线性范围为5.0 n M~10.0μM,检测限为1.7 n M;对其他5种非同类结构抗生素分子区分系数介于-0.002~0.009之间,对KMY-B区分系数为0.84;响应时间为~240 s;用于实际样品牛奶、自来水和血清的分析评价,其SE%值分别为176.5±15.2%、407.4±21.0%和126.9±14.0%。除响应速度外,该传感器的总体性能好于S-1。三、可以预测,呈茎环变化构型带动亚甲基蓝(MB)标记物的效率会高于CSP转变为CSP/KMY-A复合物变化构型,有利于提高SE%,进而改善灵敏度。基于此,以适体为捕获探针(CP),一段自身呈茎环型结构DNA为辅助兼信号探针(ASP),设计并成功构建了基于目标物诱导茎环“开关”信号机制的双探针体系传感器(S-3)。实验优化了CP和ASP的比例、混合探针浓度、CP/ASP双链长度和检测温度4个影响传感器构建和工作效率的关键参数。在优化条件下,该传感器用于KMY-A检测,添加2.0 m M浓度下SE%为801.1±32.0%;线性范围为2.5 n M~10.0μM,检测限为0.83 n M;对其他5种非同类结构抗生素分子区分系数介于0.0005~0.0071之间,对KMY-B区分系数为0.64;响应时间为~60 s;用于实际样品牛奶、自来水和血清的分析评价,其SE%值分别为342.9±15.2%、665.4±21.0%和260.3±18.2%。四、前三种传感器均采用MB标记探针限定在电极表面的方式。该方式因将MB固定在电极表面一定范围内,背景电流难以有效降低。为解决这一问题,借助信号探针(SP)游离的思路设计并构建了基于目标物诱导SP转移信号机制的“双撑型”三探针体系传感器(S-4)。在该传感器结构中,CP/AP双链采用“双撑”方式共嫁接于金电极表面,SP游离于溶液体系。实验优化了CP和AP比例、混合探针浓度、SP浓度、AP长度和检测温度5个影响传感器构建和工作效率的关键参数。在优化条件下,该传感器用于KMY-A检测,添加2.0 m M浓度下DS值为0.81±0.08μA,SE%为35000±6250%;线性范围为100 p M~1.0μM,检测限为30 p M;对其他5种非同类结构抗生素分子区分系数介于-0.004~0.0021之间,对KMY-B区分系数为0.49;响应时间为~15 min;用于实际样品牛奶、自来水和血清的分析评价,其DS值分别为纯工作介质中DS值的44.4±3.6%、48.1±4.2%和26.0±2.8%。五、在S-4结构上进行适当变化,将CP/AP双链采用“单撑”方式即仅AP嫁接于金电极表面构建了S-5传感器。该传感器呈现出与S-4完全相反的杂交阻力减小的作用模式,有效提高了传感效率,改善了传感综合性能。在优化条件下,该传感器用于KMY-A检测,添加2.0 m M浓度下DS值为1.98±0.12μA,SE%为70000±8850%;线性范围为10 p M~1.0μM,检测限为3.3 p M;对其他5种非同类结构抗生素分子区分系数介于-0.0012~0.0005之间,对KMY-B区分系数为0.47;响应时间为~9 min;用于实际样品牛奶、自来水和血清的分析评价,其DS值分别为纯工作介质中DS值的46.2±3.2%、65.0±4.0%和40.1±2.8%。
【学位单位】：哈尔滨理工大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：O657.1
【部分图文】：

图 1-1 适体筛选技术流程图Fig. 1-1 Scheme for the SELEX1.2.3 传感器分类与结构电化学技术被广泛地用于食品和水中污染物的检测[41-45]。因其检测成本低、操作简单快速、携带方便、易微型化和实现在线监测，具有极好的应用化和商业化前景，与其他技术相比，显示出明显的优势。根据输出参数如阻抗、电流和电位，电化学适体传感器一般可对应分为三种类型，即阻抗型传感器、电流型（安培/伏安）传感器和电位（电势）型传感器。这些检测技术与适体筛选技术相结合，极大地促进了适体传感器的发展，为解决复杂基质样品中各类污染物分析提供了可行解决方案[46-50]。电化学适体传感器一般结构如图 1-2 所示。全部系统主要由敏感分子识别元件和转换器两部分组成。转换器部件一般又包括修饰层、电极基底和电学系统三部分。用作修饰层的物质如有机分子、导电聚合物和纳米材料等起着适体和基底的连接作用，可有效改善电子传递效率实现电信号的扩增。用作基底的一般是由不同材料做成的电极，如金电极（AuE）、玻碳电极（GCE）、铟锡氧

图 1-2 电化学适体传感器结构示意图Fig.1- 2 the schematic diagram of E-aptasensor construction1.3 卡那霉素电化学适体传感器研究进展卡那霉素是氨基糖苷类抗生素的重要亚类之一，广泛应用于治疗革兰阳性和革兰阴性菌引起的严重感染，在临床和畜牧中均有应用。在实际生产和生活中，过度使用和滥用以及对其废弃物不合理处置等常会导致食品如牛奶、饮用水和人体内含有一定的残留。长期接触或食用含有卡那霉素残留的物品或食品可引起人耳毒性、肾毒性和耐药性，造成人体正常生理功能紊乱，危害人体健康[53]。为提前预防并及时消除这些潜在的危害影响，建立既快速又准确的分析方法实现对卡那霉素残留水平的监测具有重要意义[54]。近 5 年来，随着适体筛选技术的发展和卡那霉素适体的报导，采用核酸适体为分子识别元件的电化学卡那霉素适体传感器的研究引起了人们广泛关注，共有 13 个[55-67]相关工作进行了报导，具体参数总结对比列于表 1-1，分别为采用阻抗技术和三种伏安技术即差分脉冲伏安技术（DPV）、方波伏安技术（SWV）

图 1-3 卡那霉素适体传感器的表面修饰和构建示意图[55]Fig.1- 3 Schematic diagram of surface modification and fabrication of kanamycin aptasensor[5.3.2 电流型适体传感器.3.2.1 基于 LSV 技术 LSV 是一种电化学伏安法技术。其做法是在电解池和电极之间施加一个线性电位扫描（电位与时间为线性关系）。在具体测试中现单次和多次扫描。依据测定获得的电流-电位曲线上峰电流与目标物之间性关系可进行定量分析，比较适合于发生吸附反应的测定，因而在传感器一定的应用[70]。韩国釜山国立大学化学系 Zhu Y[56]研究组采用在金电极表饰导电聚合物聚-[2,5-二-(2-噻吩基)-1H-吡咯-1-(p-苯甲酸)]（poly-DPB）来电子传递效率并借助 EDC:NHS 化学反应实现适体耦合，构建了基于 LSV的适体传感器（图 1-4）。DPB 在金电极表面的自组装过程采用扫描电镜（TEM术和紫外-可见光谱（UV-vis）进行观察，适体修饰过程以光电子能谱（XP术和电化学阻抗（EIS）技术进行表征，采用 LSV 技术进行定量测定。在条件下，该传感器对目标物检测获得了 0.05-9.0 μM 的线性范围和 9.4±0.4 n检测限。
【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 察冬梅;;浅议灵敏度、检出限和测定限[J];大学化学;2011年04期

本文编号：2870626