木质素对纤维素酶的吸附性质及机制和酶的理性改造

发布时间：2020-11-09 15:05

　　 将可再生的木质纤维素通过生物转化生产液体燃料和化学品,是解决当前石油煤炭等化石资源短缺、能源匮乏问题的有效途径之一。其中,利用纤维素酶将木质纤维素水解成可发酵的单糖是木质纤维素生物转化的关键步骤。天然木质纤维素原料具有结构致密、化学组成复杂多样等特点,赋予了木质纤维素天然的“生物质抗降解屏障(Biomass recalcitrance)”,其中木质素的存在是影响木质纤维素酶解效率的主要原因之一。木质素对纤维素酶的“非生产性”吸附,对酶解效率有明显的阻碍作用。预处理是破除木质纤维素原料抗降解屏障,提高纤维素的酶解效率的重要途径,是木质纤维素生物转化过程中不可缺少的步骤。在众多预处理方法之中,热水(liquid hot water,LHW)预处理具有不添加任何化学试剂、环境友好、可有效提高秸秆等原料酶解效率等优点,使其具有较高的应用价值。但热水预处理后,物料中仍含有较多的木质素。同时预处理过程中引起的木质素结构和性质的变化,也将影响木质素对纤维素酶的吸附,从而影响纤维素酶解的效率。但迄今为止,对木质素吸附对不同纤维素酶组分的影响规律、木质素与不同纤维素酶的结合机制、预处理对木质素吸附纤维素酶的影响及其影响机制等方面仍缺乏深入的认识,对如何减少木质素对纤维素酶的非生产性吸附也缺乏理论指导。基于以上背景,本论文在预处理对木质素吸附纤维素酶的影响及其机制、木质素对纤维素酶系和主要纤维素酶组分的吸附性质、木质素与不同酶的结合机制、通过酶分子改造减少木质素对酶吸附性能、以及木质素对不同酶的吸附对酶解的影响等方面开展了系统的研究工作,并取得良好进展。研究对通过对纤维素酶系的优化、对不同酶分子进行理性改造、寻找合理的预处理方法等途径,减少木质素对纤维素酶和酶解的不利影响,提高木质纤维素酶解效率具有重要理论指导意义,对通过酶的理性改造提高酶对纤维素的结合以促进底物的降解、以及如何提高纤维素酶的回收利用等也具有较好的参考价值。本论文的主要研究内容和取得的结果如下:(1)不同热水预处理强度的木质素对纤维素酶系的吸附性质玉米秸秆进行不同强度的热水预处理(预处理强度分别为3.6,3.9和4.2)后,提取预处理底物中的木质素,对其理化性质和结构进行分析发现:与未预处理原料中的木质素相比,预处理后木质素分子量增加,多分散性降低,酚羟基和脂肪族羟基数量增加,而甲基和亚甲基数量减少,木质素的电负性和疏水性也发生变化。比较预处理前后木质素对纤维素酶的吸附性质发现,热水预处理增强了木质素对纤维素酶的吸附。分析发现,木质素性质和结构的变化可能是造成预处理前后木质素对纤维素酶吸附出现差异的原因,例如:预处理后木质素表面疏水性的增加,有利于木质素和酶的疏水性结合;木质素表面负电荷的增加,增加了纤维素酶-木质素之间的静电引力;而一些化学基团的变化,如酚羟基数量的增加也是促进木质素-酶结合的因素。通过SDS-PAGE、酶谱等结合LC-MS/MS等方法,对木质素吸附纤维素酶前后上清液中的主要蛋白进行定性和定量分析。结果发现,木质素对纤维素酶系中不同酶组分的吸附特征存在明显差异:木质素对草酸青霉纤维素酶系中不同酶组分的吸附量呈现如下规律:CBHEGBgl和Xylanase(依次为外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶)。其中,在木质素对CBH和Bgl的吸附中,疏水性作用是影响木质素对蛋白吸附的主要因素;而对EG和Xylanase的吸附中,静电作用力对吸附的影响较大。(2)木质素对主要纤维素酶组分的吸附性质及机制通过对实验数据的综合分析,结合生物信息学模拟,研究了木质素对纤维素酶系中主要酶组分(CBHⅠ,EGⅡ和Bgls)的吸附性质和机制。通过分析CBH Ⅰ在木质素表面的结合强度及其酶活变化,发现CBH Ⅰ与木质素之间能够形成比较稳定的结合,离心、洗涤等方式难以将木质素与被吸附的蛋白分离,形成了“木质素-CBHⅠ”结合体。实验发现,“木质素-CBHⅠ”结合体依然具有降解纤维素底物的能力。通过分子对接对木质素-CBHⅠ结合位点的分析发现,木质素在CBH Ⅰ的催化结构域(CD区)的结合主要集中在非催化孔道的疏水性裂缝中,因此木质素对CD区的吸附不影响酶对纤维素的结合和酶解。CBHⅠ的CBM(纤维素结合结构域)也在酶与木质素的结合中起到重要作用。通过分析CBM与木质素最佳结合位点的氨基酸分布发现,静电作用推动了木质素对蛋白的吸附,其中57位的赖氨酸(Lys57)在吸附中起到重要作用。改变CBM区的带电性质,将带正电荷的氨基酸Lys57点突变为带负电荷的氨基酸Glu57,可以减少木质素对CBM区的吸附,而不影响CBM区与纤维素的结合。比较木质素对EG Ⅱ和CBHⅠ的吸附动力学和热力学过程发现,木质素对EGⅡ的吸附速率和吸附量都低于CBHⅠ。但是,对结合至木质素表面的EGⅡ酶活性质的分析表明,木质素对EGⅡ的吸附影响了酶对底物的结合,降低了 EGⅡ的活性。利用Auotodock对木质素与EGⅡ的结合位点进行了预测,表明木质素对EG Ⅱ的CD区的吸附区域与纤维多糖的吸附区域重合,都位于CD区开放的催化通道内,因此木质素对EGⅡ的吸附影响了酶对纤维多糖的结合和水解。由此推测,在木质纤维素的酶解中,木质素对EG的吸附可能是其影响纤维素酶水解效率的主要途径。通过比较草酸青霉的Bgll和烟曲霉的Bg13在木质素/纤维素上的吸附性质发现:木质素对Bg13的吸附较强,而纤维素对Bgl3的吸附较弱;木质素对Bgll的吸附较弱,而Bgll可以结合到纤维素的表面。对于木质素对草酸青霉的Bgll和烟曲霉的Bg13的吸附性能为何存在较大差异的原因,目前尚没有文献报道。通过生物信息学分析和对Bgls的FnⅢ区的点突变,证明了 FnⅢ区在Bg13与木质素的结合中起到重要作用,同时还发现,Bg13-FnⅢ表面的正电荷可能是促进蛋白与木质素结合的主要动力,增加pH值(由4.8提高至6.5),可以减少Bg13表面的正电荷,减少木质素对Bg13的吸附。比较Bgll和Bgl3的FnⅢ区表面电荷和氨基酸的分布发现,这两个蛋白的FnⅢ区的差异可能是引起木质素对不同Bgls吸附性质差异的原因。(3)纤维素酶分子的理性改造对木质素吸附的影响在木质素对纤维素酶的吸附机制研究基础上,对CBH Ⅰ和EGⅡ的CBM区以及Bgls的FnⅢ区进行点突变和融合等的改造,对比了改造前后木质素对不同纤维素酶吸附性质的变化以及对酶解性能的影响。将三点突变的T.r-CBMV27E,P30D,Linkl(突变的里氏木霉CBH Ⅰ的CBM区)分别与CBHⅠ和EGⅡ融合,结果发现,嵌合蛋白CBH-CBMV27E,P30D,Linkl和EG-TrCBMV27E,P30D,Linkl对底物表现出较高的酶解能力。SEM观察发现,酶解过程中CBH-CBMV27E,P30D,Link1和EG-TrCBMV27E,P30D,Link1对纤维底物破坏能力增强,酶解后暴露出更多的纤维素酶结合位点,这可能是其具有较高酶解能力的原因。将Bgl3的FnⅢ区与Bgl1的催化结构域融合,得到的嵌合蛋白Bgl1-3。与Bgl1相比,Bgl1-3对木质素的吸附亲和力增加,而对纤维素的吸附亲和力降低。但嵌合蛋白Bgl1-3具有较高的酶解能力,进一步证明了 FnⅢ区在Bgls对底物结合中的重要作用。在CBH/Bgls共存的反应体系中,加入Bgls减少了 CBH在木质素和微晶纤维素等底物上的吸附量。由于Bgls的酶解底物是纤维二糖而非纤维素,因此纤维素对Bgls的吸附可能并不利于酶解的进行,这可能是纤维素对Bgl1-3具有较低的吸附,但是Bgl1-3却具有较高酶解能力的原因之一。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：O636.2;Q55
【部分图文】：

在过去的研宄中，人们己经发现了很多不同的预处理方法，大体上可以分为??化学法、物理法、理化法、生物法以及不同预处理方法的组合。虽然目前不同预??处理对底物化学成分、物理结构的修饰或改变的研究还不充分，但是所有预处理??方法的目的都是打破底物结构，去除底物中对酶解有害的成分，从而实现提高酶??解效率，增加酶解产量的目的。??理想的预处理方法可以使得纤维素、半纤维素和木质素充分的分离，从而将??纤维素完全暴露，有利于纤维素酶对纤维素的结合和酶解。半纤维素主要位于纤??维的表面和纤维素簇之间，在预处理中是最易改变和溶出的物质（Ｃｈａｎｄｒａ?ｅｔ?ａｌ．，??２００７）。但是，木质素为了保护木质纤维素免受外界的侵蚀，以矩阵状分布于纤??维素间，加强了纤维素结构的稳定性，很难从纤维素中分离出来（Ｇｉｌ?ｅｔａｌ．，?２０１０）。??很多预处理技术是以去除或改变底物中的木质素成分为目的（Ｈｉｍｍｅ丨ｅｔ?ａｌ．，２００７；??Ｌｉ?＆?Ｚｈｅｎｇ，?２０１７）。但是，从成本上考虑，大多数预处理方法都很难去除原料中??

态；Ｃ：木质素的基本结构：基本组分和主要化学键。??Ｆｉｇ?１－２?Ｔｈｅ?ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ?ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ?ａｎｄ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｌｉｇｎｉｎ?ｉｎ?ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ．?Ａ：?ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ??ｏｆ?ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；?Ｂ：?ｌｉｇｎｉｎ?ｉｓｏｌａｔｅｄ?ｆｒｏｍ?ｐｏｐｌａｒ；?Ｃ：?ｔｈｅ?ｂａｓｉｃ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｌｉｇｎｉｎ（Ｌｉ?ｅｔ?ａｌ．，?２０１６）．??１．１．２不同预处理对木质素结构的影响??１．１．２．１酸预处理对木质素结构的影响??Ｍｅｎｇ等认为稀酸预处理是比水和碱预处理更为有效的预处理方法。稀酸预??处理后底物的表层微纤维间出现了纳米孔，增加了纤维素酶与底物的接触面积，??促进了酶解的进行（Ｍｅｎｇ?ｅｔａｌ．，?２０１５）。但是稀酸预处理后，大量的木质素残留在??底物中，而且酸性预处理后的木质素对纤维素材料的酶解有明显的抑制作用。预??处理中木质素理化性质的变化可能促进了木质素对酶解的影响。Ｈｕａｎｇ等发现，??稀酸预处理明显的改变了木质素的结构：分子量增加，分子均一性增加，同时木??，ｕａｎａ．。??

?Ｍｉ??ＯＨ??图１－２木质素的作用及基本结构：Ａ：木质素在木质纤维素中的分布；Ｂ：木质素的基本形??态；Ｃ：木质素的基本结构：基本组分和主要化学键。??Ｆｉｇ?１－２?Ｔｈｅ?ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ?ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ?ａｎｄ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｌｉｇｎｉｎ?ｉｎ?ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ．?Ａ：?ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ??ｏｆ?ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；?Ｂ：?ｌｉｇｎｉｎ?ｉｓｏｌａｔｅｄ?ｆｒｏｍ?ｐｏｐｌａｒ；?Ｃ：?ｔｈｅ?ｂａｓｉｃ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｌｉｇｎｉｎ（Ｌｉ?ｅｔ?ａｌ．，?２０１６）．??１．１．２不同预处理对木质素结构的影响??１．１．２．１酸预处理对木质素结构的影响??Ｍｅｎｇ等认为稀酸预处理是比水和碱预处理更为有效的预处理方法。稀酸预??处理后底物的表层微纤维间出现了纳米孔，增加了纤维素酶与底物的接触面积，??促进了酶解的进行（Ｍｅｎｇ?ｅｔａｌ．，?２０１５）。但是稀酸预处理后，大量的木质素残留在??底物中，而且酸性预处理后的木质素对纤维素材料的酶解有明显的抑制作用。预??处理中木质素理化性质的变化可能促进了木质素对酶解的影响。Ｈｕａｎｇ等发现，??稀酸预处理明显的改变了木质素的结构：分子量增加，分子均一性增加，同时木??质素发生了聚合反应，表面的疏水性和负电荷数量都明显增加（Ｈｕａｎｇ?ｅｔａｌ．，?２０１６）。??同时
【参考文献】

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1 ;A novel function for the cellulose binding module of cellobiohydrolase I[J];Science in China(Series C:Life Sciences);2008年07期

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1 胡益波;青霉G蛋白信号通路对糖苷水解酶合成调控初探及其在构建表达系统中的应用[D];山东大学;2015年

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1 王菲菲;不同预处理方法对玉米秸秆木质素吸附纤维素酶特征的影响[D];山东大学;2014年

本文编号：2876602