核酸荧光探针的设计及生化分析应用

发布时间：2020-11-13 16:32

　　 核酸荧光探针因具有亲和性强、特异性好、易于合成设计等优势而广泛应用于各种目标物的检测。在本博士学位论文的研究工作中,针对已有的核酸荧光探针大多需要标记、探针制备成本高且亲和力差,以及多功能探针种类相对较少、且合成条件复杂、生物毒性较高等问题,设计了两种免标记型的核酸荧光探针和一种可生物降解的多功能纳米探针,并分别考察了其在生化分析中的应用性能,具体工作如下:1.设计了一种免标记型的荧光核酸探针,结合核酸外切酶Exo Ⅲ和二级靶标的信号放大,实现了目标核酸的低成本、高灵敏检测。探针为发夹结构,3'端含有10个突出碱基可以抵御酶的降解,茎部内藏一段与靶标DNA相同的二级靶标序列和一组C:C错配,前者可辅助信号放大,后者可嵌入荧光团ATMND并淬灭其荧光。当探针识别目标核酸后,发夹结构打开可诱发Exo Ⅲ从3'端降解核酸探针。探针的降解释放出靶标DNA、二级靶标序列和ATMND,并恢复ATMND的荧光。靶标核酸和二级靶标序列继续参与下一轮的循环,实现荧光信号的指数放大。该免标记型荧光探针可在室温、经一步操作即实现靶标DNA的高灵敏检测,最低检测限为6pM。此外,核酸荧光探针还具有较好的选择性,可区分单碱基错配,并在血清等实际样品时表现出了良好的精密度。2.设计了一种比率型的免标记荧光核酸适配体探针,实现了血清、尿液和唾液等多种复杂体系中可卡因的高灵敏快速检测。可卡因适配体GC-38的Y型疏水空腔和茎部双链区域可分别嵌入荧光团ATMND和SYBRGreenⅠ(SGI)。其中,ATMND作为荧光信号输出基团,可被可卡因选择性置换而恢复荧光;而SGI作为内标基团,其荧光不受可卡因的干扰,在测定过程中始终保持恒定。基于ATMND和SGI荧光信号比值的变化,该免标记型探针对可卡因展现出了良好的分析性能。在最优条件下,该探针的线性范围为0.1～10 μM,最低检测限为56 nM,响应时间仅需20 s,并可在尿液、唾液和血清等复杂体系中实现可卡因的检测。3.设计了一种对A549癌细胞具有靶向识别、荧光成像和光热治疗-化学治疗联合治疗作用的聚多巴胺/核酸适配体凝胶多功能纳米探针。探针为核壳结构,聚多巴胺纳米球内核具有光热性质,核酸适配体凝胶外壳既可负载药物分子,又可识别癌细胞并对其荧光成像。该多功能探针进入癌细胞内部后,在近红外光照射下,一方面可产生光热效应使细胞局域温度升高,有效杀灭癌细胞;另一方面可促使DNA凝胶解链释放出内嵌的抗癌药物Dox,实现对癌细胞的药物治疗。该多功能探针对A549细胞具有较强的靶向识别和荧光成像能力、良好的稳定性、较低的细胞毒性,较高的光热转换效率(38%)和载药量(50%),在光热治疗和化学治疗的联合作用下可将癌细胞的存活率降至48%。纳米探针集成了对癌细胞的选择性识别、荧光成像、热疗和化疗等多种功能,在癌细胞靶向识别和治疗方面具有较好的应用潜力。
【学位单位】：大连理工大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：O657.3
【部分图文】：

ｇｅｐｏｒｒ??Ｌａｂｅｌｅｄ?ＭＢ?｜??Ｌａｂｅｌ－ｆｒｅｅ?ＭＢ??图Ｕ分子信标的结构示意图％。??Ｆｉｇｕｒｅ?１．１?Ｓｃｈｅｍｅ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｂｅａｃｏｎ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ［１８］．??１９９６年Ｔｙａｇｉ和Ｋｒａｍｅｒ首次使用分子信标进行定量分析Ｗ。相对于传统的核针，分子信标不仅灵敏度高、特异性强，而且操作简便、适用于活体分析，因此在传感、生物成像和癌症治疗中都充当着重要的角色ｔ３１＿３４］。分子信标的工作原理如图所示，在没有靶标序列存在时，自由状态的分子信标呈茎环状，茎部的荧光基团和基团间的距离小于１０?ｎｍ。基于荧光共振能量转移（ＦＲＥＴ）原理，荧光团发出的荧淬灭基团吸收，并以热的形式散发出去使荧光淬灭。当目标ＤＮＡ出现时，分子信目标ＤＮＡ进行互补杂交形成双链结构，茎环结构被打开，荧光基团和淬灭基团距大，无法发生共振能量转移，荧光信号恢复。荧光的强度与溶液中靶标的量成正比关根据荧光信号的强度可以实现靶标的精准定量分析。根据热力学平衡关系，分子信靶标ＤＮＡ的杂交特异性要明显优于常规的线性探针，因此通常具有较好的选择性。??

１９９６年Ｔｙａｇｉ和Ｋｒａｍｅｒ首次使用分子信标进行定量分析Ｗ。相对于传统的核酸探??针，分子信标不仅灵敏度高、特异性强，而且操作简便、适用于活体分析，因此在生物??传感、生物成像和癌症治疗中都充当着重要的角色ｔ３１＿３４］。分子信标的工作原理如图１．２??所示，在没有靶标序列存在时，自由状态的分子信标呈茎环状，茎部的荧光基团和淬灭??基团间的距离小于１０?ｎｍ。基于荧光共振能量转移（ＦＲＥＴ）原理，荧光团发出的荧光被??淬灭基团吸收，并以热的形式散发出去使荧光淬灭。当目标ＤＮＡ出现时，分子信标与??目标ＤＮＡ进行互补杂交形成双链结构，茎环结构被打开，荧光基团和淬灭基团距离增??大，无法发生共振能量转移，荧光信号恢复。荧光的强度与溶液中靶标的量成正比关系，??根据荧光信号的强度可以实现靶标的精准定量分析。根据热力学平衡关系，分子信标与??靶标ＤＮＡ的杂交特异性要明显优于常规的线性探针，因此通常具有较好的选择性。??ｊ?Ｔａｒｇｅｔ??Ｆ?Ｑ??图１．２分子

定性好、催化反应速率快等优势。脱氧核酶的催化功能包括ＲＮＡ切割活性、ＤＮＡ切割??活性、卟啉金属化酶和过氧化物酶活性、ＤＮＡ激酶活性等。其中，应用最广泛的一类??脱氧核酶具有ＲＮＡ切割活性。如图１．３Ａ所示，这类脱氧核酶通常由底物链和酶链组成，??底物链中包含ＲＮＡ切割位点（ｒＡ），而酶链由催化环部和臂构成。辅助因子可激活脱??氧核酶，使其可以特异性地将底物链中的ＲＮＡ碱基水解切断。参与脱氧核酶催化过程??的辅助因子包括金属离子、中性分子和细菌等。金属离子是一类比较常见的辅助因子，??在核酸酶工作时可以起到促进脱氧核酶序列正确折叠以形成催化中心、保持酶的活性状??态、稳定核酸酶的中间过渡态、以及屏蔽磷酸骨架所带负电荷等作用。不同结构的脱氧??核酶依赖的金属离子的种类和程度都不同，说明脱氧核酶存在一个或几个对构象有严格??要求的金属离子结合位点。基于核酸酶活性依赖于特定金属离子的特性，多种核酸酶探??针陆续被开发并用于金属离子的高灵敏检测［３７＠。另一类常见的脱氧核酶是Ｇ－四联体??ＤＮＡｚｙｍｅ，这类酶由一段或几段富Ｇ碱基的序列构成，能在Ｋ＋，?Ｐｂ２＋或ＮＨ４＋的辅助下??折叠形成平行或反平行的四联体构型，并与氯化高铁血红素（ｈｅｍｉｎ）结合，表现出类??过氧化物酶的活性
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本文编号：2882390