虾青素合成途径关键基因的筛选及高效细胞工厂的构建

发布时间：2020-11-21 09:58

　　 类胡萝卜素是一类以异戊二烯为结构单元,有着广泛应用的高附加值萜类化合物。而虾青素是一种重要的类胡萝卜素,且是类胡萝卜素合成当中的最高级别产物,具有超强的抗氧化、消除活性单线态氧的作用,在食品、化妆品、保健品领域也有着广泛的应用前景。在虾青素代谢途径中,虾青素的合成与β-胡萝卜素酮酶(CrtW)和β-胡萝卜素羟化酶(CrtZ)有着密不可分的关系,这两种酶的活性与底物的偏好性直接关系到虾青素的产量。CrtW,CrtZ是虾青素合成途径中两个关键酶,也是代谢工程当中的两个主要的靶点。本研究以大肠杆菌为细胞工厂,对虾青素合成途径中的关键基因簇crtW-crtZ进行系统优化,主要目的是获得高水平合成虾青素的工程菌株。首先筛选并克隆了真核和原核微生物不同来源的crtW、crtZ基因,进一步将这些基因插入表达载体pCA12上,最后导入已敲除内毒素基因并过量表达β-胡萝卜素合成途径的大肠杆菌GY02进行异源表达。对发酵温度进行优化,确定了在30℃进行自诱导和生物转化。通过比较筛选获得了三组相对较好的crtW-crtZ基因组合:来源短波单胞菌的crtW和菠萝泛菌的crtZ组合(即BreW-PanZ)、来源土壤农杆菌的crtW和crtZ组合(即AauW-AauZ),以及来源雨生红球藻的crtW和土壤农杆菌的crtZ基因组合(即W148-AauZ)。这三种组合有利于虾青素的积累,对应的菌株为LY01、LY03和LY05,产量分别为 11.83 mg/g DCW,9.24 mg/g DCW,11.79 mg/g DCW。由于上述构建的虾青素报告质粒过大(除了携带两个关键基因,还有β-胡萝卜素合成途径的基因),故采取以下方式进行优化:将BreW-PanZ组合连接在四种不同拷贝数的表达质粒上,然后分别与pCA12质粒共转化大肠杆菌GY02宿主进行异源表达,这样可以减少质粒丢失现象,同时筛选出合适的质粒拷贝数。实验结果证明BreW-PanZ基因簇与中高拷贝或高拷贝质粒的适配性更好,大幅度减少了质粒丢失的现象,产量分别为10.6 mg/gDCW,10.3 mg/g DCW。由于异戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)是是萜类化合物合成途径中的两个关键的代谢中间物,也是大肠杆菌中2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸合成途径(MEPpathway)和外源甲羟戊酸途径(MVA pathway)的交汇处,调控着整个萜类代谢途径,而异戊烯基焦磷酸异构酶(IDI)是调节萜类前体物质IPP和DMAPP的异构酶,在整个代谢途径中具有重要的意义,也是代谢工程的主要靶点之一。因此本研究利用CRISPR手段在大肠杆菌染色体上整合了一个拷贝的idi基因,将不同来源基因组合的crtW-crtZ报告质粒转化此细胞中再次进行筛选,对菌株产虾青素能力进行检测后,发现过表达idi对来源土壤农杆菌的crtW和菠萝泛菌的crtZ(即AauW-PanZ)基因组合产虾青素有很大帮助,从原来的4.45 mg/gDCW提高到12.25 mg/gDCW,产量提高了 2.75倍。对LY01菌株进行高密度培养,发酵培养45.5h,菌体密度OD600可以达到183,虾青素单位干重产量为8.43 mg/g,与摇瓶发酵的产量(干重11.83 mg/g)相比减少了 28.7%。但高密度发酵有其特有的优势,单位体积产量由摇瓶产量的35.92 mg/L增加到发酵罐产量的455.68 mg/L,单位体积产量提高了 11.69倍。
【学位单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TQ920.1;O629.4
【部分图文】：

图１－２虾青素的合成途径??Ｆｉｇｌ－２?Ｔｈｅ?ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ?ｐａｔｈｗａｙ?ｏｆ?ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ??

ｋｉｎａｓｅ，ＭＶＫ）、憐酸甲轻戊酸激酶（Ｐｈｏｓｐｈｏｍｅｖａｌｏｎａｔｅ?ｋｉｎａｓｅ，ＰＭＫ）和?ＰＰＭｅｖ??脱竣酶（Ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｍｅｖａｌｏｎａｔｅｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓ，ＭＶＤ）的催化下生成前体物质异戊??烯基焦磷酸（ＩＰＰ），如图１－３。经ＩＰＰ异构酶（ＩＤＩ）的作用，ＩＰＰ与ＤＭＡＰＰ两??种前体物质之间进行异构化，最终进入下游产物的合成途径［６］，如图１－２。??６??

３０?ｍｉｎ，流动性Ｂ的浓度－？立控制在０，总流速为０．５?ｍＬ／ｍｉｎ。采州紫夕卜检测器??在最大吸收值４７５?ｎｍ处测吸收峰面积，再根据标准曲线计算虾青素的产量。以??虾青素浓度为横坐标，液相峰面积为纵坐标，标准曲线如图２－２。??？２５００００?｜？峰面积??？?２３３０８５??ｖ?＝?Ｓ）８２０８ｘ－９８３３．５?乂??２０００００?■?Ｒ－＝?０．９９９７??ｖ？１７２０７６??ｉｓｏｏｏｏ?－??ｍ＾ＵＡＳＯｌ??１０００００?＊??５００００?？?ＪＩ５０７４１??虾Ｗ素浓度（ｍｇ／Ｌ）??■?１９４６５??（）＇？■？？？？??ｏ?ｏ．ｓ?ｉ?ｉｓ?ｉ?２．ｒ＞?３??图２－２虾青素标准曲线??Ｆｉｇ．２－２?Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ?ｓｔａｎｄａｒｄ?ｃｕｒｖｅ??由图２－２可知，此标准曲线的回归方程为：ｙ＝９８２０８ｘ－９８３３．５，相关系数??Ｒ２＝０．９９９７。相关系数在０．９９９以上，表明其相关性良好，可川于定量分析虾青??素浓度。??２９??
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本文编号：2892844