基于DNA循环放大通用型荧光生物传感器的研究
发布时间：2021-02-18 18:53
建立快速、高灵敏度和高选择性的通用型生物传感器是生化分析工作者的重要任务。通用型生物传感器是指使用相同的工作原理,通过改变个别测定单元以达到检测不同物质的目的,其突出优点是适用的普遍性。高灵敏度的检测方法很多是基于多重循环的DNA信号放大。DNAzyme是一种具有催化功能的DNA片段,由结合位点和识别催化位点组成,可以与底物杂交并裂解底物。与传统的蛋白质酶相比,DNAzyme具有多功能性设计、在室温和高温稳定、低成本、易于合成和标记的特点。G-三链体结构被认为是G-四链体结构折叠过程最合理的中间体之一,这种结构在体外也显示出类似于G-四链体的催化功能。由于G-三链体具有更少的G碱基个数,在设计富G发夹时颈部的G-C更少,设计更为灵活。很多核酸染料与G-三链体作用所产生的荧光信号,可根据荧光信号强度的不同来定量检测目标物。本论文主要是以G-三链体作为荧光信号探针,利用DNAzyme的催化剪切和核酸切割酶辅助目标物循环并依据核酸染料的光谱特性,构建不同的通用型荧光生物传感器,分别对DNA、金属离子和蛋白质进行检测:（1）基于Exo III辅助循环和DNAzyme扩增超灵敏的荧光检测H5N1...
【文章来源】：湘潭大学湖南省
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
基于氧化石墨烯和ssDNA吸附作用的通用型生物传感器原理图
第1章绪论3图1-2基于Ru络合物对量子点荧光猝灭的通用型生物传感器原理图1.2G-三链体1.2.1G-三链体的介绍G-四链体是一种特殊的DNA二级结构，在1962年被第一次发现[12]。三维立体结构的G-四链体是通过Hoogsteen氢键相互作用连接成平面螺旋的四分体结构，当其以非共价结合时小分子配体形成无标记探针，故而有催化和点亮荧光的功能。由于它们的生物学意义和固有优势，所以基于G-四链体的无标记探针已广泛应用于生物过程检测[13]。然而，在应用于生化检测和分析时，G-四链体在控制和释放其结构存在一些问题[14]。例如，G-四链体与富含C的序列结合太紧密而使其难与目标物脱钩[14]。因此，用较短的富G序列可能更适合生物传感器的制造。最近，G-三链体被确认是一种新型的DNA结构，是由3个G片段组成的富G序列，类似于G-四链体，但是核酸个数要少于G-四链体，由于其生物功能潜力和特殊的结构受到人们的广泛关注[15]。公认的G-三链体结构被普遍是G-四链体结构折叠过程最合理的中间体之一[13,14,16]。同时，这种结构在体外也显示出类似于G-四链体的催化功能[13]。通过核磁共振和元二色谱以及示差扫描量热法得出G-三链体是以Hoogsteen氢键连接的。此外，溶液状态下的G-三链体可被原子力显微镜观察到[14,16]。这种新型的G-三链体可用于设计新型的荧光分子信标。由于G-三链体具有更少的G碱基个数，在设计富G发夹时颈部的G-C更少些，是设计更为灵活[13]。除此之外，G-三链体同G-四链体一样可被ThT诱导折叠，
第1章绪论4并增强其荧光强度[17-19]。1.2.2G-三链体的应用G-三链体作为标记物具有成本低、易获得和稳定性好的特点，而且以核酸作为标记物，减少了非特异性吸附，使传感器灵敏度增加；此外，在探针设计上也更为灵活，核酸序列可调控，可以设计包含目标物识别区域和其他功能区域。Rong-MeiKong等人[20]建立了一个基于G-三链体的功能分子信标无标记的荧光传感系统，该系统的发夹结构稳定由Hg2+介导。实验原理图如1-3所示，在存在Hg2+的情况下，由于“T-Hg2+-T”的强相互作用，含有“T”碱基的扩展G-三链体序列可以形成稳定的发夹结构，从而导致富G序列锁定在茎中。但是，当加入目标物谷胱甘肽（GSH），通过更强的“GSH-Hg2+”相互作用便可以打开发夹结构，使富G序列处于游离状态，因此，在加入荧光染料硫黄素T（ThT）时，便可与G-三链体结合产生强的荧光信号，从而达到检测的目的。这项工作可能会扩展G-三链体作为功能性分子信标对小生物分子检测无标记荧光探针的新视野。图1-3基于G-三链体和ThT的无标记荧光传感器的原理图RuiyingLi等人[21]将G-三链体与等温指数扩增反应（EXPAR）结合在一起，以实现简单而灵敏的生物传感策略。实验原理图如1-4所示，HIV-DNA作为目标物，EXPAR过程是通过HIV-DNA与G3模板A"区的杂交而触发的。在加入聚合酶和dNTP的情况下，部分双链体沿模板延伸以产生完整的dsDNA。在Nt.BstNBI和DNA聚合酶的剪切和聚合作用下，从而释放短的DNA链（BX）和G-三链体（B）。同时，切口反应引发新的延伸、切割和释放（表示为循环I）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于λ核酸外切酶辅助放大的化学发光传感器用于DNA的灵敏检测[J]. 陈佳,郭芸芸,陈桥,邱洪灯. 分析化学. 2015(10)
[2]基于核酸切割酶与脱氧核酶的荧光循环放大系统检测铅（Ⅱ）[J]. 赵永席,齐林,杨卫军,魏帅,王亚玲. 分析化学. 2012(08)
硕士论文
[1]基于生物信号放大技术的核酸适配体传感新方法研究[D]. 陈志超.湖北师范大学 2019
[2]荧光及共振瑞利散射光谱法检测环境中痕量手性污染物[D]. 黄云梅.重庆三峡学院 2019
[3]高信背比DNA酶-SYBR Green I化学发光传感体系的研究[D]. 张后春.成都理工大学 2018
[4]基于物联网平台的紫外可见分光光度计自动测量系统研究[D]. 晏健荣.东华大学 2017
[5]基于滚环扩增和核酸外切酶Ⅲ辅助循环放大的高灵敏荧光生物传感器研究[D]. 刘陈力为.湖南大学 2016
[6]基于荧光光谱法的农用车尾气成分检测的研究[D]. 林大星.安徽农业大学 2013
本文编号：3039955
【文章来源】：湘潭大学湖南省
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
基于氧化石墨烯和ssDNA吸附作用的通用型生物传感器原理图
第1章绪论3图1-2基于Ru络合物对量子点荧光猝灭的通用型生物传感器原理图1.2G-三链体1.2.1G-三链体的介绍G-四链体是一种特殊的DNA二级结构，在1962年被第一次发现[12]。三维立体结构的G-四链体是通过Hoogsteen氢键相互作用连接成平面螺旋的四分体结构，当其以非共价结合时小分子配体形成无标记探针，故而有催化和点亮荧光的功能。由于它们的生物学意义和固有优势，所以基于G-四链体的无标记探针已广泛应用于生物过程检测[13]。然而，在应用于生化检测和分析时，G-四链体在控制和释放其结构存在一些问题[14]。例如，G-四链体与富含C的序列结合太紧密而使其难与目标物脱钩[14]。因此，用较短的富G序列可能更适合生物传感器的制造。最近，G-三链体被确认是一种新型的DNA结构，是由3个G片段组成的富G序列，类似于G-四链体，但是核酸个数要少于G-四链体，由于其生物功能潜力和特殊的结构受到人们的广泛关注[15]。公认的G-三链体结构被普遍是G-四链体结构折叠过程最合理的中间体之一[13,14,16]。同时，这种结构在体外也显示出类似于G-四链体的催化功能[13]。通过核磁共振和元二色谱以及示差扫描量热法得出G-三链体是以Hoogsteen氢键连接的。此外，溶液状态下的G-三链体可被原子力显微镜观察到[14,16]。这种新型的G-三链体可用于设计新型的荧光分子信标。由于G-三链体具有更少的G碱基个数，在设计富G发夹时颈部的G-C更少些，是设计更为灵活[13]。除此之外，G-三链体同G-四链体一样可被ThT诱导折叠，
第1章绪论4并增强其荧光强度[17-19]。1.2.2G-三链体的应用G-三链体作为标记物具有成本低、易获得和稳定性好的特点，而且以核酸作为标记物，减少了非特异性吸附，使传感器灵敏度增加；此外，在探针设计上也更为灵活，核酸序列可调控，可以设计包含目标物识别区域和其他功能区域。Rong-MeiKong等人[20]建立了一个基于G-三链体的功能分子信标无标记的荧光传感系统，该系统的发夹结构稳定由Hg2+介导。实验原理图如1-3所示，在存在Hg2+的情况下，由于“T-Hg2+-T”的强相互作用，含有“T”碱基的扩展G-三链体序列可以形成稳定的发夹结构，从而导致富G序列锁定在茎中。但是，当加入目标物谷胱甘肽（GSH），通过更强的“GSH-Hg2+”相互作用便可以打开发夹结构，使富G序列处于游离状态，因此，在加入荧光染料硫黄素T（ThT）时，便可与G-三链体结合产生强的荧光信号，从而达到检测的目的。这项工作可能会扩展G-三链体作为功能性分子信标对小生物分子检测无标记荧光探针的新视野。图1-3基于G-三链体和ThT的无标记荧光传感器的原理图RuiyingLi等人[21]将G-三链体与等温指数扩增反应（EXPAR）结合在一起，以实现简单而灵敏的生物传感策略。实验原理图如1-4所示，HIV-DNA作为目标物，EXPAR过程是通过HIV-DNA与G3模板A"区的杂交而触发的。在加入聚合酶和dNTP的情况下，部分双链体沿模板延伸以产生完整的dsDNA。在Nt.BstNBI和DNA聚合酶的剪切和聚合作用下，从而释放短的DNA链（BX）和G-三链体（B）。同时，切口反应引发新的延伸、切割和释放（表示为循环I）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于λ核酸外切酶辅助放大的化学发光传感器用于DNA的灵敏检测[J]. 陈佳,郭芸芸,陈桥,邱洪灯. 分析化学. 2015(10)
[2]基于核酸切割酶与脱氧核酶的荧光循环放大系统检测铅（Ⅱ）[J]. 赵永席,齐林,杨卫军,魏帅,王亚玲. 分析化学. 2012(08)
硕士论文
[1]基于生物信号放大技术的核酸适配体传感新方法研究[D]. 陈志超.湖北师范大学 2019
[2]荧光及共振瑞利散射光谱法检测环境中痕量手性污染物[D]. 黄云梅.重庆三峡学院 2019
[3]高信背比DNA酶-SYBR Green I化学发光传感体系的研究[D]. 张后春.成都理工大学 2018
[4]基于物联网平台的紫外可见分光光度计自动测量系统研究[D]. 晏健荣.东华大学 2017
[5]基于滚环扩增和核酸外切酶Ⅲ辅助循环放大的高灵敏荧光生物传感器研究[D]. 刘陈力为.湖南大学 2016
[6]基于荧光光谱法的农用车尾气成分检测的研究[D]. 林大星.安徽农业大学 2013
本文编号：3039955
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/huaxue/3039955.html
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