多维液相色谱串联质谱分析水稻叶片蛋白质组学的研究
发布时间：2021-03-24 23:14
水稻,作为重要的粮食作物,是全球超过一半以上人口生存的食物来源,深入了解水稻生长发育过程及调控具有重要的意义。结合目前多维液相色谱分析植物蛋白质组学的发展趋势,本论文建立二维液相色谱和三维液相色谱串联质谱技术,以灌浆期的水稻叶片为实验材料,通过优化多维液相色谱的流动相酸碱度及馏分收集数目等参数,旨在建立正交性高、分离度好的多维液相色谱串联质谱技术分析水稻叶片蛋白质组学。实验主要研究成果包括如下:1.本实验建立了离线亲水作用-反相二维液相色谱结合馏分收集技术分析水稻叶片蛋白质。通过考察亲水作用色谱和反相色谱流动相的酸碱度对系统正交性的影响,得到如下结论:亲水作用色谱（pH 9.3）和反相色谱（pH 3.3）的条件下结合可实现较好正交性R2=0.34113,并且该方法在实际水稻叶片蛋白质分析中也表现出较好的正交性和分离能力。2.分别优化了二维液相色谱系统中馏分收集数目和一维液相色谱粗肽段上样量等参数。实验从鉴定蛋白质数目、蛋白物理化学性质等方面考察了馏分收集数目（12组、22组和42组）和一维液相色谱粗肽段上样量（2 mg、4 mg和6 mg）对水稻叶片蛋白质鉴定数目...
【文章来源】：浙江工业大学浙江省
【文章页数】：89 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
离线方式的多维液相色谱系统
图 2.1 22 组馏分收集组合示意图Fig. 2.1 Scheme of 22 concatenation strategy第二维纳升液相色谱系统采用 Thermo EASY 1000 Nanoflow 液相色维液相色谱条件：Acclaim PepMap RSLC (50 μm × 15 cm, 2 μm) 色谱cclaim PepMap 100 (70 μm × 2 cm，3 μm) Trap 柱；流动相 A：0.1%甲酸酸乙腈；流速：0.3 μL/min；进样体积：2 μL。梯度洗脱如下：4%–8%%–30% B，102 min；30%–90% B，10 min；90% B，4 min。质谱鉴定利用 Thermo LTQ 线性离子阱质谱仪，质谱条件如下：N子扫描方式，设置离子传输毛细管温度为 300°C，电喷雾电压：1.9 撞能量为 35%。数据依赖模式对 MS 和 MS/MS 进行图谱信息扫描，扫描 (m/z 300–2000)，全扫描中丰度最高的 10 个离子峰进行 MS/M排除 (dynamic exclusion) 设置为：重复次数为 1 次，动态排除时间
流动相的酸碱度。在反相色谱流动相确定为酸性条件的基础上，如图 2.2 (2D 和 2E) 所示：随亲水作用色谱 pH 从碱性降低到中性，21 种标准肽段在二维液相色谱系统的正交性几乎没有影响; 但当亲水作用色谱 pH 从中性降低到酸性图 2.2 (2E 和 2F)，二液相色谱对肽段的保留行为上表现出明显的差异，校正保留时间线性拟合系数从0.59887 降低到 0.34113。以肽段 2 和 21 为例, 亲水性肽段 2 (GRAVY = –1.625) HILIC 色谱柱到 RP 色谱柱的保留时间从 50 min 缩短到 14 min；疏水性肽段 21(GRAVY = 0.503) 在两维色谱的保留时间从 25 min 延长到 116 min。综上所述，p9.3 和 pH 3.3 分别被选择为亲水作用色谱和反相色谱的流动相酸碱度。此外，反相色谱因分离效率高、流动相与质谱兼容等优点被前人广泛的应用于二维液相色谱系统的最后一维[67,59]，因此我们选择亲水作用色谱和反相色谱分别作为二维液相色谱系统的第一维和第二维。
【参考文献】：
期刊论文
[1]一种反相/弱阳离子交换混合模式色谱填料结合质谱在蛋白质组学中的应用[J]. 周珊珊,刘佳玉,张养军,钱小红. 中国科学:生命科学. 2018(02)
[2]高分辨飞行时间质谱在蛋白质组学相对定量分析中的应用[J]. 洪晓愉,王浩,徐金玲,李水明,王勇. 分析化学. 2016(03)
[3]植物激素调控水稻花器官发育分子机制的研究进展[J]. 沈卫平,蔡强,周锋利,张建中,张大兵,袁政. 植物生理学报. 2015(05)
[4]亲水/反相二维色谱法制备桔梗中的三萜皂苷[J]. 邢倩倩,傅青,金郁,梁鑫淼. 色谱. 2014(07)
[5]纳升级反相液相色谱-串联质谱法分析蜈蚣提取蛋白质[J]. 陈霞,文红梅,刘睿,朱栋,李伟,周红光,吴勉华. 分析化学. 2014(02)
[6]多维液相色谱分离技术在复杂蛋白质组学样品鉴定中的应用[J]. 张罗敷,胡晓芳,徐学敏. 现代生物医学进展. 2013(01)
[7]双水相萃取结合液相色谱法分离蛋白质[J]. 赵新颖,屈锋,董敏,陈凡,罗爱芹,张经华. 分析化学. 2012(01)
[8]Thermo Scientific Q Exactive台式四极杆-轨道阱高分辨质谱仪[J]. 王勇为,叶芳挺. 中国食品. 2011(22)
[9]去除血浆中高丰度蛋白质的二维液相色谱体系的建立[J]. 朱绍春,张学洋,高明霞,晏国全,张祥民. 色谱. 2011(09)
[10]高效液相色谱法在蛋白质分离检测中的应用[J]. 吴少辉,张成桂,刘光明. 畜牧与饲料科学. 2011(08)
硕士论文
[1]水稻半显性卷叶突变体erll的遗传分析与基因定位[D]. 徐静.中国农业科学院 2013
[2]三维串联液质联用蛋白质组学分离方法的建立[D]. 张罗敷.上海交通大学 2012
[3]中药二维液相色谱分析体系的建立[D]. 梁征.华东理工大学 2012
[4]新型二维液相色谱体系的建立、评价及其应用[D]. 余丹华.华东理工大学 2011
[5]在线蛋白二维液相色谱仪的构建及应用[D]. 张会强.西北大学 2009
[6]正—反相正交二维液相色谱系统构建及评价[D]. 兰韬.南京理工大学 2008
[7]现代液相色谱和质谱联用技术用于半边莲药材的研究[D]. 周颖.上海交通大学 2008
[8]蛋白质组学中的多维液相色谱—质谱技术研究及其在胰腺癌标志物筛选中的应用[D]. 陈刚.西北大学 2006
[9]稀土元素镧对逆境胁迫下水稻幼苗生长的影响研究[D]. 张杰.安徽师范大学 2005
[10]水稻无侧根突变体RM109的蛋白质组学研究[D]. 白月.东北农业大学 2004
本文编号：3098574
【文章来源】：浙江工业大学浙江省
【文章页数】：89 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
离线方式的多维液相色谱系统
图 2.1 22 组馏分收集组合示意图Fig. 2.1 Scheme of 22 concatenation strategy第二维纳升液相色谱系统采用 Thermo EASY 1000 Nanoflow 液相色维液相色谱条件：Acclaim PepMap RSLC (50 μm × 15 cm, 2 μm) 色谱cclaim PepMap 100 (70 μm × 2 cm，3 μm) Trap 柱；流动相 A：0.1%甲酸酸乙腈；流速：0.3 μL/min；进样体积：2 μL。梯度洗脱如下：4%–8%%–30% B，102 min；30%–90% B，10 min；90% B，4 min。质谱鉴定利用 Thermo LTQ 线性离子阱质谱仪，质谱条件如下：N子扫描方式，设置离子传输毛细管温度为 300°C，电喷雾电压：1.9 撞能量为 35%。数据依赖模式对 MS 和 MS/MS 进行图谱信息扫描，扫描 (m/z 300–2000)，全扫描中丰度最高的 10 个离子峰进行 MS/M排除 (dynamic exclusion) 设置为：重复次数为 1 次，动态排除时间
流动相的酸碱度。在反相色谱流动相确定为酸性条件的基础上，如图 2.2 (2D 和 2E) 所示：随亲水作用色谱 pH 从碱性降低到中性，21 种标准肽段在二维液相色谱系统的正交性几乎没有影响; 但当亲水作用色谱 pH 从中性降低到酸性图 2.2 (2E 和 2F)，二液相色谱对肽段的保留行为上表现出明显的差异，校正保留时间线性拟合系数从0.59887 降低到 0.34113。以肽段 2 和 21 为例, 亲水性肽段 2 (GRAVY = –1.625) HILIC 色谱柱到 RP 色谱柱的保留时间从 50 min 缩短到 14 min；疏水性肽段 21(GRAVY = 0.503) 在两维色谱的保留时间从 25 min 延长到 116 min。综上所述，p9.3 和 pH 3.3 分别被选择为亲水作用色谱和反相色谱的流动相酸碱度。此外，反相色谱因分离效率高、流动相与质谱兼容等优点被前人广泛的应用于二维液相色谱系统的最后一维[67,59]，因此我们选择亲水作用色谱和反相色谱分别作为二维液相色谱系统的第一维和第二维。
【参考文献】：
期刊论文
[1]一种反相/弱阳离子交换混合模式色谱填料结合质谱在蛋白质组学中的应用[J]. 周珊珊,刘佳玉,张养军,钱小红. 中国科学:生命科学. 2018(02)
[2]高分辨飞行时间质谱在蛋白质组学相对定量分析中的应用[J]. 洪晓愉,王浩,徐金玲,李水明,王勇. 分析化学. 2016(03)
[3]植物激素调控水稻花器官发育分子机制的研究进展[J]. 沈卫平,蔡强,周锋利,张建中,张大兵,袁政. 植物生理学报. 2015(05)
[4]亲水/反相二维色谱法制备桔梗中的三萜皂苷[J]. 邢倩倩,傅青,金郁,梁鑫淼. 色谱. 2014(07)
[5]纳升级反相液相色谱-串联质谱法分析蜈蚣提取蛋白质[J]. 陈霞,文红梅,刘睿,朱栋,李伟,周红光,吴勉华. 分析化学. 2014(02)
[6]多维液相色谱分离技术在复杂蛋白质组学样品鉴定中的应用[J]. 张罗敷,胡晓芳,徐学敏. 现代生物医学进展. 2013(01)
[7]双水相萃取结合液相色谱法分离蛋白质[J]. 赵新颖,屈锋,董敏,陈凡,罗爱芹,张经华. 分析化学. 2012(01)
[8]Thermo Scientific Q Exactive台式四极杆-轨道阱高分辨质谱仪[J]. 王勇为,叶芳挺. 中国食品. 2011(22)
[9]去除血浆中高丰度蛋白质的二维液相色谱体系的建立[J]. 朱绍春,张学洋,高明霞,晏国全,张祥民. 色谱. 2011(09)
[10]高效液相色谱法在蛋白质分离检测中的应用[J]. 吴少辉,张成桂,刘光明. 畜牧与饲料科学. 2011(08)
硕士论文
[1]水稻半显性卷叶突变体erll的遗传分析与基因定位[D]. 徐静.中国农业科学院 2013
[2]三维串联液质联用蛋白质组学分离方法的建立[D]. 张罗敷.上海交通大学 2012
[3]中药二维液相色谱分析体系的建立[D]. 梁征.华东理工大学 2012
[4]新型二维液相色谱体系的建立、评价及其应用[D]. 余丹华.华东理工大学 2011
[5]在线蛋白二维液相色谱仪的构建及应用[D]. 张会强.西北大学 2009
[6]正—反相正交二维液相色谱系统构建及评价[D]. 兰韬.南京理工大学 2008
[7]现代液相色谱和质谱联用技术用于半边莲药材的研究[D]. 周颖.上海交通大学 2008
[8]蛋白质组学中的多维液相色谱—质谱技术研究及其在胰腺癌标志物筛选中的应用[D]. 陈刚.西北大学 2006
[9]稀土元素镧对逆境胁迫下水稻幼苗生长的影响研究[D]. 张杰.安徽师范大学 2005
[10]水稻无侧根突变体RM109的蛋白质组学研究[D]. 白月.东北农业大学 2004
本文编号：3098574
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