盖子环替换及定点突变提高菜豆环氧化物水解酶对邻甲基苯基缩水甘油醚的催化性能

发布时间：2021-03-25 21:38

　　菜豆环氧化物水解酶1和2（Pv EH1、Pv EH2）能够动力学拆分外消旋邻甲基苯基缩水甘油醚（rac-o MGE）,从而保留（R）-o MGE。基于对Pv EH1和Pv EH2结构的同源模拟和分析,发现二者分子中的盖子环差异较大,故本文选择盖子环作为研究目标。经融合聚合酶链式反应（FPCR）,获得了Pv EH2的盖子环区域被Pv EH1对应区域替换的杂合酶Pv2Pv1。用全细胞酶E. coli/pv2pv1催化rac-o MGE,当（S）-o MGE刚好水解完全时,产物（S）-3-邻甲苯基-1,2-丙二醇（（S）-o TPD）的eep由Pv EH2的58.3%提高至75.5%。为进一步提高酶的性质,在Pv2Pv1中选取11个氨基酸位点进行丙氨酸（A）突变,获得最优突变子E. coli/pv2pv1K176A,活性为E. coli/pv2pv1（4.2U/g）的2.1倍,且当S构型的底物刚好完全水解时,（S）-o TPD的eep进一步提高为80.3%。分子对接分析发现,盖子环替换和K176位点突变为A,均使（R）-o MGE环氧环中的Cα更易受到酶中D101位点的攻击。利用E. col... 

【文章来源】：化工进展. 2020,39(07)北大核心EICSCD

【文章页数】：7 页

【部分图文】：

200mg/mL E.coli/pv2pv1K176A水解150mmol/L rac-o MGE的进程图

将Pv2Pv1和另外4种植物来源的EH的一级结构进行同源序列比对，找出非保守氨基酸（同源性≤60%）。根据1.3节方法对Pv2Pv1同源建模，再通过AutoDock4.2软件（http://autodock.scripps.edu）进行分子对接，用PyMOL找出距离(R)-o MGE 8?以内的非保守氨基酸，并通过两轮全质粒PCR将这些氨基酸突变为丙氨酸（A）。根据相关文献设计突变引物[10]。一轮PCR所用的上游引物为设计的突变引物，下游引物为通用引物pColdⅡ-R，预变性95℃，4min；变性98℃，10s；退火55℃，5s；延伸72℃，1min；从变性到延伸循环30次，最后充分延伸，72℃，10min。二轮PCR以一轮PCR产物为引物，全质粒为模板，除延伸时间变为5min，其他条件同第一轮。产物经限制性内切酶Dpn I消化后导入E.coli BL21(DE3），培养12h后对转化子进行菌液PCR验证，并对阳性转化子进行测序，将测序结果正确的转化子命名为E.coli/pv2pv1突变位点。1.7 分子对接分析

Pv EH1和Pv EH2的三维模拟结构比对

【参考文献】：
期刊论文
[1]环氧水解酶的结构基础及新酶开发[J]. 孔旭东,郁惠蕾,周佳海,许建和.  生物加工过程. 2013(01)

硕士论文
[1]菜豆环氧化物水解酶PvEH1的催化性质及分子改造研究[D]. 叶慧华.江南大学 2017
[2]绿豆环氧水解酶VrEH2催化性质研究及分子改造的初步探索[D]. 吴燕雯.华东理工大学 2015
[3]绿豆环氧水解酶基因克隆、表达及酶学性质表征[D]. 贺婉红.华东理工大学 2011



本文编号：3100369