连接依赖循环信号放大法灵敏检测DNA甲基转移酶活性

发布时间：2021-07-30 07:17

　　基因组DNA甲基化（DNA methylation）是重要的表观遗传修饰,在调节基因转录,染色质结构,胚胎发育和细胞衰老等方面发挥着至关重要的作用。精确量化DNA甲基化不仅对早期疾病诊断、预后和治疗起着关键作用,对生化研究和新药物研发也具有十分重要的意义。DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase,简称DNA MTase）负责DNA甲基化的修饰,异常的DNA MTase活性可能会破坏正常的DNA甲基化模式,进而诱发包括肺癌、乳腺癌、肝癌等在内的多种癌症。目前用于DNA MTase测定的传统方法通常繁琐费力且灵敏度较低。除此之外很多人还采用一些信号扩增策略来提高检测灵敏度,但是由于非特异性扩增导致检测特异性较差,因此灵敏度并没有得到很大的提高。所以开发准确而灵敏的DNA MTase检测方法对于了解癌症发生机制和发现抗癌药物至关重要。在本论文中,我们首次开发了一种基于单核糖核苷酸修复介导的连接依赖循环信号放大的新荧光方法高灵敏地检测DNA MTase的活性。选用的核糖核酸酶（Ribonuclease HII,简称RNase HII）可以切除单个核糖核苷酸,导致信号探针的循... 

【文章来源】：山东师范大学山东省

【文章页数】：62 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

A基于发夹DNA酶探针的DamMTase活性检测示意图

山东师范大学硕士学位论文5图1-1A基于发夹DNA酶探针的DamMTase活性检测示意图。图1-1B基于甲基化反应的DNA机器对DamMTase活性的检测示意图。1.2.2.2电化学测定法一直以来，电化学生物传感器一直受到研究者的广泛关注，这种方法具有以下许多优势：操作便捷，简单高效，灵敏度高，响应速度快，生产成本低，易于小型化等[65,66]。因此有望在研究DNA甲基化这一领域发挥巨大的潜力[67-69]。1.2.2.2.1结合氧化石墨烯的电化学法截止目前，电化学技术已被广泛用于DNA的分析检测[70-72]，。一些研究人员专注于通过电子回旋共振纳米碳膜电极[68,69]和多壁碳纳米管膜电极[73]对寡核苷酸中的甲基胞嘧啶和胞嘧啶直接进行电化学氧化，以此对DNA甲基化进行电化学测定。这些工作都是仅提供DNA甲基化信息的检测方法。而基因特异性甲基化的电化学分析面临的最大挑战是鉴

山东师范大学硕士学位论文6定甲基化胞嘧啶在DNA序列中的具体位置。蔡称心课题组[35]报告了一种检测基因特异性甲基化和测定MTase活性的电化学方法。如方案图1-2所示，他们使用HpaII核酸内切酶提高实验的选择性，并利用氧化石墨烯（GO）的信号放大策略来进一步提高检测的灵敏度。他们巧妙的设计是通过固定在电极表面的DNA探针与目标DNA杂交而开发的（从HCT116细胞中提取了来自智人p53基因第8外显子启动子区的137个merDNA）。实验测定是基于报告子（硫氨酸）的电化学反应，该报告子在M.SssIMTase的催化下发生甲基化并进一步被核酸内切酶HpaII裂解（HpaII[74]是基因特异性甲基化分析中广泛使用的一种限制性酶，它能识别双链对称序列5"-CCGG-3"并催化胞嘧啶之间的双链裂解），然后通过氧化石墨烯（GO）再与探针DNA的3"-末端偶联。这种模型可以确定CpG位点的DNA甲基化，并且能够将目标DNA序列与单碱基错配序列区分开。他们研究发现电化学信号与M.SssI活性呈线性关系，当信噪比为3时，M.SssI的线性范围为0.1-450U/mL，检测限为（0.050.02）U/mL。这种检测方法有诸多优点：易于操作，有良好的特异性和较高的选择性等。此外，他们还证明该方法可用于快速评估和筛选DNAMTase的抑制剂，并在早期疾病诊断、新抗癌药物的研发领域具有潜在的应用意义。图1-2基于氧化石墨烯和限制性核酸内切酶的电化学信号扩增用于基因特异性DNA甲基化检测和MTase活性测定示意图。


本文编号：3310969