常见鳕科鳕鱼的3种分子鉴定技术研究
发布时间：2021-08-03 16:33
鳕鱼通常指鳕形目鱼类,包含大西洋鳕鱼、太平洋鳕鱼、黑线鳕等经济价值较高的重要鱼类。在我国,鳕鱼的消费量逐年递增,市售鳕鱼种类繁多,其市场价格也差异悬殊。然而,大多数鳕鱼被加工制成冷冻鱼片等产品进行销售,而且产品包装缺乏正确的学名标注。消费者难以从外观上辨别出鳕鱼的真假和所属种类,由此造成了鳕鱼市场命名混乱,以次充好的复杂现状。因此,急需建立一些快速准确、简便实用的检测方法应用于市售鳕鱼成分的检测。本文以鳕科鳕鱼为研究对象,选择易与鳕鱼混淆的南极犬牙鱼和异鳞蛇鲭为阴性对照,采用荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）体系、环介导等温扩增技术（LAMP）以及胶体金（AuNPs）比色检测技术对其进行种类鉴定与分析。主要研究结果如下:1.选择16S rDNA基因设计区分鳕科和非鳕科鱼类的引物,选用线粒体Cytb基因分别设计针对大西洋鳕鱼、太平洋鳕鱼、黑线鳕、南极犬牙鱼以及异鳞蛇鲭的物种特异性引物,建立qPCR体系,对其进行物种鉴定分析。检测结果表明,所建立的qPCR体系具有良好的特异性和重复性,其中16S rDNA qPCR体系能够快速有效区分鳕科与非鳕科物种,5种物种特异性qPCR体系能有效鉴定目...
【文章来源】：浙江工商大学浙江省
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
6SrDNAqPCR体系和物种特异性qPCR体系的绝对定量标准曲线
18图2.316SrDNAqPCR体系和物种特异性qPCR体系的相对定量标准曲线Fig.2.3Relativequantitativestandardcurvesofspecies-specificand16SrDNAgenesinqPCRassay注：a：混合鳕鱼样品在16SrDNAqPCR体系中的相对定量标准曲线；b：混合鳕鱼样品在物种特异性qPCR体系中的相对定量标准曲线。GMO：大西洋鳕鱼；GMA：太平洋鳕鱼；MA：黑线鳕；DE：南极犬牙鱼；FL：异鳞蛇鲭。Note:a:Relativequantitativestandardofmixedsamplesin16SrDNAqPCRsystem;b:Relativequantitativestandardcurveofmixedsamplesinaspecies-specificqPCRsystem.GMO:G.morhua;GMA:G.macrocephalus;MA:M.aeglefinus;DE:D.eleginoides;LF:L.flavobrunneum.2.2.6市售鳕鱼及鳕鱼深加工制品的检测从当地市场购得20种鳕鱼产品（其中包括5种深加工制品），采用本研究建立的qPCR体系进行物种检测。检测结果如表2.4所示，20种检测样品中有14种在16SrDNA体系中显示阳性，表明其确实属于鳕科（与产品标签一致）。其中挪威北极鳕（8号和9号样品）是大西洋鳕鱼中的一种，是挪威海产局为了强调产地和物种另起的商品名称。2种深加工样品（1号和5号）中出现大西洋鳕鱼和太平洋鳕鱼同时检出的现象，由于国内市场中太平洋鳕鱼价格低于大西洋鳕鱼，说明在市售鳕鱼的加工制品中存在以次充好的现象。值得注意的是，3、6、7、11、17、19号样品产品名称分别为鳕鱼饼、鳕鱼切片、无头鳕鱼、黑鳕鱼、南极犬牙鱼和鳕鱼柳，但检测结果发现其不属于常见的大西洋鳕、太平洋鳕和黑线鳕，也不属于鳕科鱼类。为进一步验证qPCR体系的检测结果，采用常规PCR方法对20种检测样品进行扩增并将扩增产物进行测序（2.1.4.2）。结果显示，qPCR体系检测出的阳性结果与DNA测序结果一致。二者的区别在于：1号和5号样品测序结果显示为单一
28果一致，说明了本研究中设计的针对3种鳕鱼以及鳕科鳕鱼的4种LAMP体系具有较强的特异性，可用于鳕鱼物种的快速鉴定。图3.1LAMP荧光法（上）和LAMP指示剂法（下）的特异性检测Fig.3.1SpecificitytestoffluorescenceLAMP(top)andvisualLAMP(bottom)assays.注：1.在A，B，C中，“其它”代表除该体系针对的目标鳕鱼外的物种；lane1：目标鳕鱼；lane2-3：非目标鳕鱼；lane4-5：非鳕鱼物种；lane6:空白对照。2.在D中，“其它”代表除3种目标鳕鱼物种外的非鳕科物种；lane1：大西洋鳕鱼；lane2：太平洋鳕鱼；lane3：黑线鳕；lane4：南极犬牙鱼；lane5：异鳞蛇鲭；lane6：空白对照。3.GMO：大西洋鳕；GMA：太平洋鳕；MA：黑线鳕；DE：南极犬牙鱼；FL：异鳞蛇鲭；CK：空白对照。Note:1.In(A,B,andC),othersrepresentedthenon-targetcodspeciesandnon-codspecies;lane1:targetcodDNA,lane2-3:non-targetcodspecies;lane4-5:non-codspecies;lane6:theblankcontrol.2.In(D),othersrepresentedthenon-codspeciestestedinthisstudy.lane1:G.morhua;lane2:G.macrocephalus;lane3:M.aeglefinus;lane4:D.eleginoides;lane5:L.flavobrunneum;lane6:theblankcontrol.3.GMO:G.morhua;GMA:G.macrocephalus;MA:M.aeglefinus.DE:D.eleginoides;LF:L.flavobrunneum;CK:notemplatecontrols.3.2.3LAMP体系的灵敏度分析通过紫外-可见分光光度计在260nm波长下的测定，大西洋鳕鱼DNA平均浓度为285ng/μL，太平洋鳕鱼DNA平均浓度为370ng/μL，黑线鳕DNA平均浓度197ng/μL。将3种鳕鱼样品的DNA进行10倍连续梯度稀释，用于绝对灵敏度分析。如图3.2所示，LAMP荧光法和LAMP指示剂法的检测限一致，在3种鳕鱼的物种特异性LAMP体系中（图3.2
【参考文献】：
期刊论文
[1]环介导等温扩增技术检测食品安全的研究进展[J]. 王静,许鑫,王雪雨,姚伦广,阚云超,冀君. 中国生物工程杂志. 2018(11)
[2]鳕鱼副产品的综合利用[J]. 王鸿泽,赵聪颖,兰海铭,赵丛枝,马玉青. 食品安全导刊. 2018(09)
[3]石首鱼科海洋鱼类DNA条形码的构建[J]. 蒋芝华,丁棒棒,王熠,丁艳菲,朱诚. 核农学报. 2018(04)
[4]环介导恒温扩增技术在食品检测中的应用[J]. 赵彩红,高强,李明生,徐红伟. 农业科技与信息. 2017(22)
[5]鱼类DNA条形码技术的应用进展[J]. 陈信忠,郭书林,龚艳清. 水产科学. 2017(06)
[6]即食鳕鱼骨的工艺及其风味外撒粉的配方研究[J]. 王文勇,张英慧,赖长生. 食品工业. 2017(10)
[7]建立一种快速鉴定大西洋鳕鱼及其制品的SYBR Green荧光PCR方法[J]. 孙晓飞,蒋丹,万超,刘淑艳,吴斌. 东北师大学报(自然科学版). 2017(03)
[8]等温扩增技术的原理及其在病原检测中的应用[J]. 高瑶,孟星宇,罗玉子,胡永浩,仇华吉. 动物医学进展. 2017(08)
[9]黑线鳕鱼皮胶原蛋白胰蛋白酶酶解多肽对UVB诱导HaCaT光损伤的抑制作用[J]. 董丽莎,李妍妍,张红燕,崔晨茜,韩姣姣,王朝阳,司开学,周君,芦晨阳,苏秀榕. 食品科学. 2018(10)
[10]实时荧光定量PCR技术在肉及肉制品中的应用[J]. 陈益春,牛海力,孔保华. 食品工业科技. 2017(17)
博士论文
[1]鳕鱼等海产品物种防伪及保护的分子鉴定技术[D]. 方绍庆.南京农业大学 2011
硕士论文
[1]常见柔鱼科鱿鱼品种的分子鉴定技术研究[D]. 叶剑.浙江工商大学 2017
[2]基于DNA条形码的鱼片（肉）真伪鉴别技术研究[D]. 李新光.上海海洋大学 2013
[3]鳕鱼排加工关键技术研究[D]. 王桓.河北农业大学 2013
[4]松江鲈（Trachidermus fasciatus）种群的形态学与遗传学研究及四种鳕鱼的遗传学研究[D]. 毕潇潇.中国海洋大学 2009
本文编号：3319952
【文章来源】：浙江工商大学浙江省
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
6SrDNAqPCR体系和物种特异性qPCR体系的绝对定量标准曲线
18图2.316SrDNAqPCR体系和物种特异性qPCR体系的相对定量标准曲线Fig.2.3Relativequantitativestandardcurvesofspecies-specificand16SrDNAgenesinqPCRassay注：a：混合鳕鱼样品在16SrDNAqPCR体系中的相对定量标准曲线；b：混合鳕鱼样品在物种特异性qPCR体系中的相对定量标准曲线。GMO：大西洋鳕鱼；GMA：太平洋鳕鱼；MA：黑线鳕；DE：南极犬牙鱼；FL：异鳞蛇鲭。Note:a:Relativequantitativestandardofmixedsamplesin16SrDNAqPCRsystem;b:Relativequantitativestandardcurveofmixedsamplesinaspecies-specificqPCRsystem.GMO:G.morhua;GMA:G.macrocephalus;MA:M.aeglefinus;DE:D.eleginoides;LF:L.flavobrunneum.2.2.6市售鳕鱼及鳕鱼深加工制品的检测从当地市场购得20种鳕鱼产品（其中包括5种深加工制品），采用本研究建立的qPCR体系进行物种检测。检测结果如表2.4所示，20种检测样品中有14种在16SrDNA体系中显示阳性，表明其确实属于鳕科（与产品标签一致）。其中挪威北极鳕（8号和9号样品）是大西洋鳕鱼中的一种，是挪威海产局为了强调产地和物种另起的商品名称。2种深加工样品（1号和5号）中出现大西洋鳕鱼和太平洋鳕鱼同时检出的现象，由于国内市场中太平洋鳕鱼价格低于大西洋鳕鱼，说明在市售鳕鱼的加工制品中存在以次充好的现象。值得注意的是，3、6、7、11、17、19号样品产品名称分别为鳕鱼饼、鳕鱼切片、无头鳕鱼、黑鳕鱼、南极犬牙鱼和鳕鱼柳，但检测结果发现其不属于常见的大西洋鳕、太平洋鳕和黑线鳕，也不属于鳕科鱼类。为进一步验证qPCR体系的检测结果，采用常规PCR方法对20种检测样品进行扩增并将扩增产物进行测序（2.1.4.2）。结果显示，qPCR体系检测出的阳性结果与DNA测序结果一致。二者的区别在于：1号和5号样品测序结果显示为单一
28果一致，说明了本研究中设计的针对3种鳕鱼以及鳕科鳕鱼的4种LAMP体系具有较强的特异性，可用于鳕鱼物种的快速鉴定。图3.1LAMP荧光法（上）和LAMP指示剂法（下）的特异性检测Fig.3.1SpecificitytestoffluorescenceLAMP(top)andvisualLAMP(bottom)assays.注：1.在A，B，C中，“其它”代表除该体系针对的目标鳕鱼外的物种；lane1：目标鳕鱼；lane2-3：非目标鳕鱼；lane4-5：非鳕鱼物种；lane6:空白对照。2.在D中，“其它”代表除3种目标鳕鱼物种外的非鳕科物种；lane1：大西洋鳕鱼；lane2：太平洋鳕鱼；lane3：黑线鳕；lane4：南极犬牙鱼；lane5：异鳞蛇鲭；lane6：空白对照。3.GMO：大西洋鳕；GMA：太平洋鳕；MA：黑线鳕；DE：南极犬牙鱼；FL：异鳞蛇鲭；CK：空白对照。Note:1.In(A,B,andC),othersrepresentedthenon-targetcodspeciesandnon-codspecies;lane1:targetcodDNA,lane2-3:non-targetcodspecies;lane4-5:non-codspecies;lane6:theblankcontrol.2.In(D),othersrepresentedthenon-codspeciestestedinthisstudy.lane1:G.morhua;lane2:G.macrocephalus;lane3:M.aeglefinus;lane4:D.eleginoides;lane5:L.flavobrunneum;lane6:theblankcontrol.3.GMO:G.morhua;GMA:G.macrocephalus;MA:M.aeglefinus.DE:D.eleginoides;LF:L.flavobrunneum;CK:notemplatecontrols.3.2.3LAMP体系的灵敏度分析通过紫外-可见分光光度计在260nm波长下的测定，大西洋鳕鱼DNA平均浓度为285ng/μL，太平洋鳕鱼DNA平均浓度为370ng/μL，黑线鳕DNA平均浓度197ng/μL。将3种鳕鱼样品的DNA进行10倍连续梯度稀释，用于绝对灵敏度分析。如图3.2所示，LAMP荧光法和LAMP指示剂法的检测限一致，在3种鳕鱼的物种特异性LAMP体系中（图3.2
【参考文献】：
期刊论文
[1]环介导等温扩增技术检测食品安全的研究进展[J]. 王静,许鑫,王雪雨,姚伦广,阚云超,冀君. 中国生物工程杂志. 2018(11)
[2]鳕鱼副产品的综合利用[J]. 王鸿泽,赵聪颖,兰海铭,赵丛枝,马玉青. 食品安全导刊. 2018(09)
[3]石首鱼科海洋鱼类DNA条形码的构建[J]. 蒋芝华,丁棒棒,王熠,丁艳菲,朱诚. 核农学报. 2018(04)
[4]环介导恒温扩增技术在食品检测中的应用[J]. 赵彩红,高强,李明生,徐红伟. 农业科技与信息. 2017(22)
[5]鱼类DNA条形码技术的应用进展[J]. 陈信忠,郭书林,龚艳清. 水产科学. 2017(06)
[6]即食鳕鱼骨的工艺及其风味外撒粉的配方研究[J]. 王文勇,张英慧,赖长生. 食品工业. 2017(10)
[7]建立一种快速鉴定大西洋鳕鱼及其制品的SYBR Green荧光PCR方法[J]. 孙晓飞,蒋丹,万超,刘淑艳,吴斌. 东北师大学报(自然科学版). 2017(03)
[8]等温扩增技术的原理及其在病原检测中的应用[J]. 高瑶,孟星宇,罗玉子,胡永浩,仇华吉. 动物医学进展. 2017(08)
[9]黑线鳕鱼皮胶原蛋白胰蛋白酶酶解多肽对UVB诱导HaCaT光损伤的抑制作用[J]. 董丽莎,李妍妍,张红燕,崔晨茜,韩姣姣,王朝阳,司开学,周君,芦晨阳,苏秀榕. 食品科学. 2018(10)
[10]实时荧光定量PCR技术在肉及肉制品中的应用[J]. 陈益春,牛海力,孔保华. 食品工业科技. 2017(17)
博士论文
[1]鳕鱼等海产品物种防伪及保护的分子鉴定技术[D]. 方绍庆.南京农业大学 2011
硕士论文
[1]常见柔鱼科鱿鱼品种的分子鉴定技术研究[D]. 叶剑.浙江工商大学 2017
[2]基于DNA条形码的鱼片（肉）真伪鉴别技术研究[D]. 李新光.上海海洋大学 2013
[3]鳕鱼排加工关键技术研究[D]. 王桓.河北农业大学 2013
[4]松江鲈（Trachidermus fasciatus）种群的形态学与遗传学研究及四种鳕鱼的遗传学研究[D]. 毕潇潇.中国海洋大学 2009
本文编号：3319952
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