β-半乳糖苷酶与小分子荧光探针复合物的结构生物学研究
发布时间：2021-09-19 18:41
β-半乳糖苷酶（β-gal）作为一个典型的酶,已经被证明是一个重要的研究细胞衰老的生物标记物。而目前与衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）是体外和体内最广泛使用的细胞衰老的生物标记物,故实时监测亚细胞水平的β-gal活性至关重要。近年来许多研究都主要通过荧光探针在生物体系中进行可视化成像来研究细胞衰老。本研究的主要目的:通过解析β-半乳糖苷酶与荧光探针分子的三维晶体结构,阐明其主要相互作用,揭示β-半乳糖苷酶识别荧光探针的结构生物学基础,为以后荧光探针分子的设计和优化提供依据。本论文构建了来自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶（E.coliβ-gal）“TIM”催化结构域的活性氨基酸Glu537的突变体E537Q的表达菌株:sumo-β-gal E537Qp ET21a/BL21（DE3）以及通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建人源的β-半乳糖苷酶（humanβ-gal）的表达菌株:humanβ-gal-p Fast Bac/DH10Bac。之后经进一步表达提纯成功获得纯度大于95%的E.coliβ-gal E537Q蛋白。然后我们通过浸泡法获得三种经筛选的荧光分子（GY1,GY...
【文章来源】：西北大学陕西省 211工程院校
【文章页数】：88 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
E.coliβ-半乳糖苷酶的四聚体结构
西北大学硕士学位论文4而垂直的对称轴形成“激活”界面[8]。在每个单体中的活性位点都存在金属离子Mg2+和Na+，这些金属离子对酶的功能也很重要[13]。2.E.coliβ-半乳糖苷酶的单体结构图1.3E.coliβ-半乳糖苷酶的单体结构形成E.coliβ-半乳糖苷酶单体的1023个氨基酸残基大多数形成五个明确定义的结构域[11]。这些结构包含果冻卷状(jelly-rolltypebarrel)的Domain1，具有纤连蛋白III型结构(fibronectintypeIII-likebarrels)的Domain2和Domain4，由288个残基形成的β-三明治(β-sandwich)结构的Domain5以及具有中心“TIM桶”结构的Domain3形成（图1.3）。与所有其他包含“TIM桶”结构域的已知酶一样，E.coliβ-半乳糖苷酶的活性位点位于该结构域中心的C末端，活性位点形成一个深坑，可很好地进入“TIM桶”结构域的核心。另外，活性位点还包括来自同一单体的第一、第五结构域的环，除了来自同一单体的这些成分外，还有一个回路来自不同单体的结构域2，并通过“激活界面”延伸到相邻的活性位点。1.2.3E.coliβ-半乳糖苷酶的催化机制
西北大学硕士学位论文6图1.5E.coliβ-半乳糖苷酶与配体结合时相互作用的示意图A：乳糖与E537Q突变体的“浅度”结合模式(PDBID:1jyn)；B：半乳糖内酯与天然酶的“深度”结合模式(PDBID:1jz7)E.coliβ-半乳糖苷酶与配体的结合方式有两种，底物类似物和一种产物（异乳糖）结合在活性位点的“浅”位，即浅度结合模式，而中间体、过渡态类似物和另一种产物（半乳糖）则结合在“深”位,即深度结合模式[14]。当配体处于浅度结合时，它与Glu461和Glu537是预先结合的，不属于催化上正确的并置。此时糖苷氧与潜在的酸催化剂之间的距离(6)较大，因此底物需要朝更深的模式移动才能发生裂解，浅度结合主要的相互作用为底物平行于Trp999并与其进行堆叠交互[14]。其他重要的相互作用主要是与底物半乳糖基部分。随着反应的进行，底物必须移动约1~4深入到活性位点才能开始催化。因为只有在较深的位置上，底物才相对于催化残基(Glu461和Glu537)处于正确的位置，即Glu461接触糖苷氧，亲核试剂Glu537接触异头碳中心，形成中间过渡态。且蛋白残基与过渡态的半乳糖基部分的相互作用很重要，尤其是，该部分会与Trp568发生堆积相互作用，此时2-OH可以直接与Asn460，Glu461和Glu537相互作用。如图1.5所示，在两种结合模式下，半乳糖基6-OH直接配位到活性位点Na+，但Mg2+与配体并没有直接相互作用。除半乳糖复合物外，更深层的结合模式还伴随着酶构象的变化，Phe601旋转且从Domain5开始的794-804环向着活性位点移动了10。结构数据已经表明，半乳糖基有两个重叠但不同的位点，一个浅而一个深，每个位点的酶和底物之间都有特定的氢键。相反，在葡萄糖亚位点的结合相对不清楚，主要是通过与Trp999的堆积相互作用来确定的。这种非特异性结合与酶对各种糖苷配基的相
【参考文献】：
期刊论文
[1]β-半乳糖苷酶荧光探针的研究进展[J]. 李檬,高天初,朱为宏. 中国科学:化学. 2017(08)
本文编号：3402134
【文章来源】：西北大学陕西省 211工程院校
【文章页数】：88 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
E.coliβ-半乳糖苷酶的四聚体结构
西北大学硕士学位论文4而垂直的对称轴形成“激活”界面[8]。在每个单体中的活性位点都存在金属离子Mg2+和Na+，这些金属离子对酶的功能也很重要[13]。2.E.coliβ-半乳糖苷酶的单体结构图1.3E.coliβ-半乳糖苷酶的单体结构形成E.coliβ-半乳糖苷酶单体的1023个氨基酸残基大多数形成五个明确定义的结构域[11]。这些结构包含果冻卷状(jelly-rolltypebarrel)的Domain1，具有纤连蛋白III型结构(fibronectintypeIII-likebarrels)的Domain2和Domain4，由288个残基形成的β-三明治(β-sandwich)结构的Domain5以及具有中心“TIM桶”结构的Domain3形成（图1.3）。与所有其他包含“TIM桶”结构域的已知酶一样，E.coliβ-半乳糖苷酶的活性位点位于该结构域中心的C末端，活性位点形成一个深坑，可很好地进入“TIM桶”结构域的核心。另外，活性位点还包括来自同一单体的第一、第五结构域的环，除了来自同一单体的这些成分外，还有一个回路来自不同单体的结构域2，并通过“激活界面”延伸到相邻的活性位点。1.2.3E.coliβ-半乳糖苷酶的催化机制
西北大学硕士学位论文6图1.5E.coliβ-半乳糖苷酶与配体结合时相互作用的示意图A：乳糖与E537Q突变体的“浅度”结合模式(PDBID:1jyn)；B：半乳糖内酯与天然酶的“深度”结合模式(PDBID:1jz7)E.coliβ-半乳糖苷酶与配体的结合方式有两种，底物类似物和一种产物（异乳糖）结合在活性位点的“浅”位，即浅度结合模式，而中间体、过渡态类似物和另一种产物（半乳糖）则结合在“深”位,即深度结合模式[14]。当配体处于浅度结合时，它与Glu461和Glu537是预先结合的，不属于催化上正确的并置。此时糖苷氧与潜在的酸催化剂之间的距离(6)较大，因此底物需要朝更深的模式移动才能发生裂解，浅度结合主要的相互作用为底物平行于Trp999并与其进行堆叠交互[14]。其他重要的相互作用主要是与底物半乳糖基部分。随着反应的进行，底物必须移动约1~4深入到活性位点才能开始催化。因为只有在较深的位置上，底物才相对于催化残基(Glu461和Glu537)处于正确的位置，即Glu461接触糖苷氧，亲核试剂Glu537接触异头碳中心，形成中间过渡态。且蛋白残基与过渡态的半乳糖基部分的相互作用很重要，尤其是，该部分会与Trp568发生堆积相互作用，此时2-OH可以直接与Asn460，Glu461和Glu537相互作用。如图1.5所示，在两种结合模式下，半乳糖基6-OH直接配位到活性位点Na+，但Mg2+与配体并没有直接相互作用。除半乳糖复合物外，更深层的结合模式还伴随着酶构象的变化，Phe601旋转且从Domain5开始的794-804环向着活性位点移动了10。结构数据已经表明，半乳糖基有两个重叠但不同的位点，一个浅而一个深，每个位点的酶和底物之间都有特定的氢键。相反，在葡萄糖亚位点的结合相对不清楚，主要是通过与Trp999的堆积相互作用来确定的。这种非特异性结合与酶对各种糖苷配基的相
【参考文献】：
期刊论文
[1]β-半乳糖苷酶荧光探针的研究进展[J]. 李檬,高天初,朱为宏. 中国科学:化学. 2017(08)
本文编号：3402134
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