构建辅酶自循环系统全细胞催化合成S-2-氨基-1-苯基乙醇

发布时间：2021-10-17 04:15

　　S-2-氨基-1-苯基乙醇是一种重要的医药中间体,广泛应用于神经递质及抗病毒剂等多种具有生理活性药物的合成.目前其合成主要通过化学手段,虽然工艺成熟,但反应条件剧烈,且会生成许多副产物.基于新鉴定的铜绿假单胞菌来源的ω-转氨酶,设计了一个结合新金色分枝杆菌来源的醇脱氢酶的级联酶催化体系,从而将较为廉价的苯基-1,2-乙二醇一步催化合成具有高附加值的S-2-氨基-1-苯基乙醇.为了解决级联催化过程中辅酶再生和氨基供体再生问题,在该级联体系中引入大肠杆菌来源的谷氨酸脱氢酶,构建一个封闭的氧化还原自循环系统,从而实现辅酶（NADP⁺）和辅底物（L-Glu）的同时再生.最后将这3个酶串联表达在pETDuet和pACYCDuet质粒上,并转入大肠杆菌中,获得了重组菌Escherichia coli BL21（MPG）.通过重组菌全细胞转化,结果显示在100 mL、pH 8.0的NH₄Cl溶液中,37℃条件下反应10 h后,OD₆₀₀=30的该重组菌可一步催化50 mmol/L苯基-1,2-乙二醇生成光学纯的S-2-氨基-1-苯基乙... 

【文章来源】：应用与环境生物学报. 2020,26(01)北大核心CSCD

【文章页数】：8 页

【部分图文】：

辅酶自循环系统催化合成S-2-氨基-1-苯基乙醇.

(1）温度和pH对PAKω-TA酶活力及稳定性的影响：纯化后PAKω-TA酶液用于酶学特性研究.如图3a所示，相对酶活力随着pH的增加而提高，直至在pH 8.0时达到最大值.37℃温育1 h后，酶在pH 7.0-8.0之间稳定，并保持80%以上的相对活性.根据之前的研究表明，已报告的大多数ω-转氨酶的最适pH值高于pH 9.0（表3)[9,26-27].然而，该碱性条件不适合醇脱氢酶和谷氨酸脱氢酶，因为它们的最佳pH值在7.0-8.5之间.因此，本研究中使用的PAKω-TA对于多酶级联催化反应表现出很好的兼容性.温度对PAKω-TA酶活的影响如图3b所示.结果表明PAKω-TA的最佳反应温度为37℃，并且在较高温度下酶活性会降低，这可能是由于酶在高温下会热失活.热稳定性曲线显示PAKω-TA在37℃以下稳定，而随着温度的升高，酶活性显著下降，当温度达到50℃时，孵育1 h后酶活力仅保留20%.因此，PAKω-TA的最佳催化条件为37℃，pH 8.0，这也用于下一步的酶转化或全细胞生物转化.

级联催化反应进程如图5a所示，当加入足够的辅底物L-Glu和辅因子NADP+时，前2 h内MnADH能快速催化苯基-1,2-乙二醇生成S-羟基苯乙醛，然后再在PAKω-TA的作用下将S-羟基苯乙醛转化为S-2-氨基-1-苯基乙醇，而2 h后产物的生成速率逐渐降低，4 h时产物已不再增加，最终的生成S-2-氨基-1-苯基乙醇的量为28.5 mmol/L，底物苯基1,2-乙二醇也有20 mmol/L剩余.通过检测催化反应过程中pH的变化，结果如图5b所示，反应过程中pH在不断下降，这是由于辅底物L-Glu脱氨生成2-酮戊二酸（2-OG），使反应液pH降低，因此猜测底物转化率不高的原因可能是由于反应过程中pH不断下降，导致酶活力受到抑制，从而使反应终止.图5 MnADH、PAKω-TA纯酶催化合成S-2-氨基-1-苯基乙醇验证及中间过程pH变化情况.


本文编号：3441094