连接酶介导的恒温扩增方法用于多核苷酸激酶检测研究

发布时间：2021-10-26 17:21

　　多核苷酸激酶（Polynucleotide Kinase,PNK）是一种细胞内重要的修复酶,参与碱基切除修复（Base-excision repair,BER）和非同源末端连接修复（Non-homologous End Joining,NHEJ）。多核苷酸激酶能够催化磷酸基团从三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate,ATP）转移到DNA/RNA的5’-羟基末端,使其5’-末端磷酸化,从而参与DNA重组、DNA复制和DNA损伤修复等多种细胞过程。多核苷酸激酶活性异常会干扰细胞修复系统的稳定性,并诱发一系列人类疾病,如汤姆森综合征、沃纳综合征、神经退行性疾病、癌症等。因此,多核苷酸激酶被认为是重要的潜在生物标志物,可用于多种疾病的诊断和治疗,亟待发展高效、灵敏的多核苷酸激酶检测方法。然而,目前的检测方法通常存在程序繁琐、检测时间长、灵敏度低等问题。本论文为了克服以上不足,发展了一种简单快速、特异性好、灵敏度高的多核苷酸激酶检测方法。本论文中,我们提出了一种连接酶介导的恒温扩增方法用于多核苷酸激酶检测研究。我们以双链特异性核酸酶（Duplex-specific nuclea... 

【文章来源】：山东师范大学山东省

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T4多核苷酸激酶结构示意图

山东师范大学硕士学位论文2构域，其C端发挥3"-磷酸酶功能，N端参与5"-激酶反应。T4多核苷酸激酶是一种重要的核酸末端处理酶，能够将三磷酸腺苷的γ位磷酸基团转移到DNA或RNA中来催化5"-羟基末端磷酸化（如图1-2），这个过程在核酸代谢以及各种损伤修复中起着至关重要的作用[8-10]。图1-2多核苷酸激酶催化反应。1.1.2多核苷酸激酶的生物功能基因组的完整性和稳定性对于生物体来说是非常重要的，人体内高频发生的DNA损伤将严重威胁基因组稳定性会导致遗传突变，进而诱导疾病的发生[11]。DNA损伤有很多种类型，其中最严重的是细胞内每天因DNA碱基损伤或DNA糖损伤而产生的数千条DNA单链断裂，如果损伤得不到修复，这种断裂可以在DNA复制过程中转化为双链断裂，并可能导致染色体不稳定和细胞死亡[12-14]。大多数DNA修复是通过DNA连接酶在5"-磷酸和3"-羟基末端之间的连接来实现的。然而，许多DNA单链断裂与5"-羟基末端的产生有关，该末端应在连接酶介导的DNA修复之前被激酶预磷酸化[15]。因此，5"-羟基末端的磷酸化对于修复此类DNA损伤至关重要。多核苷酸激酶是许多核酸末端处理酶中的一种，将5"-羟基末端转化为5"-磷酸末端，该酶与适当的连接酶一起修复核酸中的单链断裂[16]。多核苷酸激酶在调节DNA磷酸化水平，修复DNA损伤和维持基因组稳定性中起关键作用，其活性异常可能导致许多细胞过程失调（例如DNA复制、DNA重组和链断裂的DNA损伤修复），并诱导

山东师范大学硕士学位论文5消化。当互补序列的所有核苷酸被完全去除时，HRPzyme的催化活性被彻底释放。当H2O2存在时，与血红素结合后，释放的HRPzyme催化无色ABTS2-到有色ABTS的翻转。不存在PNK的情况下，G4-发夹探针的5"末端仍保持羟基化，几乎不发生切割反应，不能与血红素结合，因此无法催化ABTS2-的氧化。因此，可以通过检测HRPzyme的释放量来测定PNK的活性。该方法具有成本低和操作简单等优势，在开发高通量的磷酸化研究方面具有广阔的应用前景。此外，该策略在研究PNK活性相关的生化分析过程以及筛选与磷酸化引发的癌症相关的药物方面具有很大的发展潜力。图1-3基于比色法检测PNK活性示意图。1.2.1.2基于荧光共振能量转移检测多核苷酸激酶荧光能量共振转移（Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET）是指在两个不同的荧光分子中，当一个荧光分子（又称为供体分子）的荧光光谱与另一个荧光分子（又称为受体分子）的激发光谱相重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减[31]。近年来，水溶性荧光共轭聚合物在生物传感领域引起了广泛关注。这些荧光聚合物含有大量具有离域电子结构的吸收单元，导致了相当高的吸收系数。荧光共轭聚合物由于其独特的光收集和荧光放大特性，已被广泛用作各种生物分子的FRET传感平台的能量供


本文编号：3459898