乙酰胆碱酯酶活性检测和抑制剂筛选新方法

发布时间：2017-05-17 17:23

  本文关键词：乙酰胆碱酯酶活性检测和抑制剂筛选新方法，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase, AChE)是一种丝氨酸水解酶,它的主要生物功能是在胆碱能突触间隙处快速水解神经递质乙酰胆碱(Acetylcholine, ATCh),使神经递质乙酰胆碱的量维持正常水平,保证神经冲动的传递。AChE在临床上是多种疾病早期诊断的标志物,在食品安全、军事领域和环境监测中常被用作检测有机磷毒物的分子识别物。 老年痴呆症,又被称为阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD),是一种神经系统疾病,病情呈进行性发展,严重威胁老年人的身心健康。目前临床上最常用的治疗AD的药物是AChE抑制剂,这些药物多为人工合成,选择性差,破坏外周其它胆碱能系统,存在不同程度的副作用,对AD的治疗并不能取得让人满意的效果。高通量筛选和寻找新型的AChE天然抑制剂,可为发现治疗AD的药物开辟新途径。 本论文以DNA稳定的荧光银纳米簇(DNA-stabilized fluorescent silver nanoclusters, DNA-AgNCs)和香豆素460为载体,分别建立可靠、敏感的检测AChE的活性及筛选其抑制剂的新方法。论文包括三个部分： 第一章为绪论,对AChE的结构、功能及其与阿尔茨海默症的关系作了简要综述；概括了AChE活性检测研究现状和AChE抑制剂研究现状。 第二章建立了一种基于DNA-AgNCs高灵敏检测AChE活性和进行抑制剂筛选的新方法。在水相中合成的被寡聚核苷酸保护的具有荧光性质的银纳米簇具有较强的荧光,良好的光谱和光物理性质。本章首先以不同模板DNA合成了多种DNA-AgNCs,比较了它们的荧光性能及对巯基胆碱的响应。最后选定以12个胞嘧啶为模板合成的dC(12)-AgNCs用于实验测定,因dC(12)-AgNCs具有较强的荧光且巯基胆碱使dC(12)-AgNCs的荧光增强。根据氯化硫代乙酰胆碱能被AChE催化水解产生TCh; dC(12)-AgNCs与TCh反应能使dC(12)-AgNCs的荧光增强,开发了一种基于dC(12)-AgNCs的检验AChE活性的荧光新方法。选取了两种AChE的典型抑制剂他克林、加兰他敏,研究了dC(12)-AgNCs用于AChE抑制剂的筛选。本方法具有高特异性,背景干扰小,检测灵敏度高。对AChE活性检测的检出限为0.00005U/mL。而且,与Ellman方法一样,本方法操作简单,反应快速,有望被广泛应用到神经生物学,毒理学,药理学等许多重要领域。 第三章介绍了一种AChE抑制剂筛选的新方法。首先从酶动力学、荧光光谱法和分子对接等方面研究了香豆素460与AChE之间的相互作用。研究表明：香豆素460对AChE的活性有一定的抑制作用,得到导致酶活力下降一半所需的抑制剂浓度为IC50=89.8±0.7μM。进而通过抑制动力学研究了香豆素460对AChE的抑制类型,结果表明为混合Ⅱ型竞争抑制,并求得KI=(7.17+0.30)×104mo1.L-1,KIs=(5.18±0.28)×104mo1·L-1,抑制常数KIKIs。荧光光谱法研究表明,香豆素460可使AChE的内源荧光猝灭,本身的荧光增强,即二者能发生荧光共振能量转移。分子对接研究表明香豆素460与AChE的活性位点丝氨酸的羟基以共价键的形式结合,并与SER124形成氢键。最后基于荧光共振能量转移的原理开发了一种配体亲和竞争AChE抑制剂筛选的新方法。因AChE具有酪氨酸和色氨酸残基,290nm激发时,在340nm处有荧光发射,其本身可作为FRET的供体。选择香豆素460为荧光基准配体。在香豆素460,AChE体系中,290nm激发时,观察到AChE中色氨酸残基在340nm处的荧光淬灭,同时观察到香豆素460在460nm处的特征荧光增强。当在反应体系中加入另一种药物分子时,若该药物小分子对AChE的抑制作用强于香豆素460,则发生竞争性结合,香豆素460部分或全部从酶分子上被置换,由于香豆素460与色氨酸残基之间距离增大,FRET不再发生。香豆素460在460nm处的荧光强度下降,据此来确定不同未知药物分子与AChE的结合作用。以加兰他敏和石杉碱甲为例,研究了香豆素460和AChE复合物用于AChE抑制剂的筛选。该方法可进行同体系测定,操作简便,成本低,且不依赖专门的仪器,有望实现高通量筛选。
【关键词】：乙酰胆碱酯酶 银纳米簇 香豆素460 荧光共振能量转移 乙酰胆碱酯酶抑制剂
【学位授予单位】：陕西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：O657.3;O629.8
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 第1章 绪论9-27
• 1.1 乙酰胆碱酯酶(AChE)简介9-15
• 1.1.1 AChE的结构9-11
• 1.1.2 AChE的分子类型和基因结构11-12
• 1.1.3 AChE的分布及应用12-13
• 1.1.4 AChE与阿尔茨海默症13-15
• 1.2 AChE的活性检测研究现状15-19
• 1.2.1 吸收光谱法15-17
• 1.2.2 荧光分析法17-19
• 1.2.3 电化学分析法19
• 1.2.4 衍射法19
• 1.3 AChE的抑制剂研究进展19-25
• 1.3.1 生物碱类21-23
• 1.3.2 萜类23
• 1.3.3 酚类23-24
• 1.3.4 黄酮类24-25
• 1.4 本论文选题思路及研究内容25-27
• 第2章 基于DNA稳定的银纳米簇(DNA-AgNCs)测定AChE活性27-43
• 2.1 引言27-28
• 2.2 本章研究思路28
• 2.3 实验部分28-30
• 2.3.1 试剂与方法28-29
• 2.3.2 DNA-AgNCs的合成29
• 2.3.3 DNA-AgNCs法测定AChE的活性29
• 2.3.4 DNA-AgNCs法筛选AChE抑制剂29-30
• 2.4 结果与讨论30-41
• 2.4.1 实验原理及验证30-34
• 2.4.2 dC(12)-AgNCs用于AChE活性的检测34-38
• 2.4.3 dC(12)-AgNCs用于AChE抑制剂的筛选38-41
• 2.5 本章小结41-43
• 第3章 基于FRET的配体亲和竞争筛选AChE抑制剂43-59
• 3.1 引言43-44
• 3.2 本章研究思路44
• 3.3 实验部分44-47
• 3.3.1 试剂与仪器44-45
• 3.3.2 溶液的配制45
• 3.3.3 香豆素460对AChE活性的影响及抑制动力学45-46
• 3.3.4 荧光法研究香豆素460与AChE的相互反应46
• 3.3.5 分子对接法研究香豆素460与AChE的相互作用46
• 3.3.6 基于FRET的配体亲和同质竞争AChE抑制剂的筛选46-47
• 3.4 实验结果与讨论47-57
• 3.4.1 香豆素460对AChE的抑制动力学47-48
• 3.4.2 香豆素460与AChE的荧光共振能量转移48-52
• 3.4.3 香豆素460与AChE的分子对接52-54
• 3.4.4 香豆素460-AChE复合物筛选AChE抑制剂54-57
• 3.5 本章小结57-59
• 结论59-61
• 参考文献61-71
• 致谢71-73
• 攻读学位期间研究成果73

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 付剑亮;邵福源;;阿尔茨海默病发病机制研究进展[J];世界临床药物;2010年07期

2 徐恩斌,张忠兵,张雷,宋森涛,林勇,宁守斌,谢渭芬;乙酰胆碱酯酶基因治疗猫贲门失弛缓症模型的实验研究[J];中华消化杂志;2004年06期

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本文编号：374055