蛋白质与配体相互作用的核磁共振波谱研究

发布时间：2023-02-28 18:37

　　蛋白质作为细胞生物功能的执行者主要取决于它们的三维结构,其中既包括天然折叠的结构蛋白,也有缺乏稳定结构的固有无序蛋白。不同的蛋白可以实现细胞不同的生理过程,蛋白质三维结构的解析有助于阐明蛋白质行使功能的分子机制。因此,蛋白质结构研究一直是生命科学领域中的一个重要部分。蛋白质与配体的相互作用是细胞实现特定功能的基础。蛋白质-配体相互作用作为细胞内一种极其重要的生物分子活动参与细胞周期的各个生物学过程,诸如信号传导、能量代谢、基因调控、酶催化、免疫反应等过程均伴随着相关蛋白质与底物、配体或小分子的结合。蛋白质-配体相互作用及其组成的作用网络的研究不仅有助于我们认识生命活动的分子机制,同时对临床疾病的诊断和治疗也具有重要意义。核磁共振波谱作为研究蛋白质结构和与其它生物分子相互作用的重要方法,特别是对溶液中蛋白质的研究独具优势。本论文选取了三个蛋白一人源蛋白GAS7-SH3,羊驼纳米抗体Nb26(两者均为天然折叠蛋白)和人源蛋白TGIF1-RD2(预测为内源性无序蛋白)作为研究对象,基于核磁共振波谱方法并结合其它生物物理和生物化学方法对它们的结构与功能展开研究,具体的研究结果如下:1.人源蛋白...

【文章页数】：157 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
缩略语表
第1章 引言
    1.1 研究对象概述
        1.1.1 生长阻滞特异性蛋白GAS7研究概述
        1.1.2. 转化生长作用因子TGIF1的研究概述
        1.1.3 纳米抗体研究概述
    1.2 核磁共振研究蛋白质三维结构
        1.2.1 核磁共振技术的基本原理及特征
        1.2.2 核磁共振解析蛋白质结构的基本参数
            1.2.2.1 化学位移
            1.2.2.2 自旋耦合
            1.2.2.3 核奥弗豪塞效应
        1.2.3 核磁共振解析蛋白质结构的一般流程
            1.2.3.1 同位素标记蛋白样品的制备
            1.2.3.2 实验数据的采集与处理
            1.2.3.3 蛋白质原子的化学位移归属
            1.2.3.4 结构计算约束条件的获取
            1.2.3.5 结构计算与优化
    1.3 蛋白质与配体相互作用的研究方法
        1.3.1 核磁滴定
        1.3.2 噬菌体展示技术
        1.3.3 酵母双杂交技术
        1.3.4 酶联免疫吸附法
    1.4 课题研究的出发点
第2章 GAS7-SH3的结构解析与特异性多肽配体的筛选
    2.1 引言
    2.2 实验材料和方法
        2.2.1 材料与仪器
            2.2.1.1 实验试剂
            2.2.1.2 实验仪器
        2.2.2 GAS7-SH3重组质粒的构建
            2.2.2.1 目的基因的扩增
            2.2.2.2 目的基因的回收以及载体的酶切、酶连
            2.2.2.3 重组质粒的转化、提取与鉴定
        2.2.3 GAS7-SH3的表达与纯化
            2.2.3.1 GAS7-SH3的表达
            2.2.3.2 ¹⁵N标记和¹³C,¹⁵N标记的蛋白表达
            2.2.3.3 GAS7-SH3的纯化
            2.2.3.4 多肽储液的配制
        2.2.4 GAS7-SH3的样品表征
            2.2.4.1 质谱测定蛋白质相对分子质量
            2.2.4.2 静态光散射实验
        2.2.5 GAS7-SH3的结构解析
            2.2.5.1 GAS7-SH3核磁数据采集与处理
            2.2.5.2 GAS7-SH3化学位移归属与结构计算
        2.2.6 GAS7-SH3蛋白特异性多肽配体的筛选
            2.2.6.1 噬菌体肽文库的扩增
            2.2.6.2 噬菌体肽文库的淘选
            2.2.6.3 噬菌体滴度的测定
            2.2.6.4 阳性噬菌体克隆的鉴定与序列测定
        2.2.7 多肽配体与GAS7-SH3蛋白的核磁滴定
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 GAS7-SH3的样品制备
        2.3.2 GAS7-SH3的液体核磁结构
        2.3.3 GAS7-SH3蛋白的功能预测
            2.3.3.1 基于蛋白质序列相似性的功能预测
            2.3.3.2 基于蛋白质三维结构的功能预测
        2.3.4 P41与GAS7-SH3蛋白的核磁滴定
        2.3.5 GAS7-SH3蛋白特异性多肽配体的筛选
    2.4 小结
第3章 TGIF1-RD2的同源寡聚及其识别辅阻遏蛋白SIN3A-PAH的分子机制研究
    3.1 引言
    3.2 实验材料与方法
        3.2.1 材料与仪器
        3.2.2 TGIF1-RD2(256-375,256-401)及SIN3A-PAH2重组质粒的构建
        3.2.3 TGIF1-RD2(256-401)突变体的构建
        3.2.4 TGIF1-RD2(256-375,256-401)及SIN3A-PAH2的表达与纯化
            3.2.4.1 TGIF1-RD2(256-375)的表达与纯化
            3.2.4.2 TGIF1-RD2(256-401)的表达与纯化
            3.2.4.3 SIN3A-PAH2的表达与纯化
        3.2.5 样品表征
        3.2.6 圆二色谱实验
        3.2.7 TGIF1-RD2(256-401)的主链化学位移归属
        3.2.8 酵母双杂交实验
        3.2.9 TGIF1-RD2(256-375,256-401)与SIN3A-PAH2的核磁滴定
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 TGIF1-RD2(256-375,256-401)和SIN3A-PAH2的样品制备
            3.3.1.1 TGIF1-RD2(256-375)的样品制备
            3.3.1.2 TGIF1-RD2(256-401)的样品制备
            3.3.1.3 SIN3A-PAH2的样品制备
        3.3.2 TGIF1-RD2(256-401)的结构特征
        3.3.3 TGIF1-RD2(256-401)的同源寡聚
            3.3.3.1 TGIF1-RD2(256-401)在细胞内的同源寡聚
            3.3.3.2 TGIF1-RD2(256-401)在溶液中的同源寡聚
        3.3.4 TGIF1-RD2(256-401)与SIN3A-PAH2的相互作用
    3.4 小结
第4章 纳米抗体Nb26识别黄曲霉毒素AFB1的分子机制研究
    4.1 引言
    4.2 实验材料和方法
        4.2.1 材料与仪器
        4.2.2 Nb26重组质粒的构建
            4.2.2.1 分子伴侣的感受态细胞制备
            4.2.2.2 目的基因的扩增
        4.2.3 Nb26的表达与纯化
        4.2.4 Nb26的样品表征
        4.2.5 Nb26的结构解析
            4.2.5.1 Nb26的核磁实验采集、数据处理及结构计算
            4.2.5.2 Nb26的T₁、T₂、{¹H}-¹⁵N NOE实验
        4.2.6 荧光滴定
        4.2.7 AFB₁与Nb26的核磁滴定
        4.2.8 holo-Nb26的主链化学位移归属
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 Nb26的可溶性表达
        4.3.2 Nb26的样品制备
        4.3.3 Nb26的液体核磁结构
        4.3.4 Nb26与AFB1的相互作用
    4.4 小结
第5章 总结与展望
    5.1 GAS7-SH3结构解析及其特异性多肽配体的筛选
    5.2 TGIF1-RD2的同源寡聚及其识别辅阻遏蛋白SIN3A-PAH2的分子机制研究
    5.3 纳米抗体Nb26识别黄曲霉毒素AFB1的分子机制研究
    5.4 展望
参考文献
附录A 国际理论与应用化学联合会各氨基酸原子命名法
附录B 实验室常用培养基及缓冲液配制
附录C T₁、T₂、{¹H}-¹⁵N NOE的处理脚本
附录D GAS7-SH3的结构质量统计表a

附录E Nb26的结构质量统计表^a

附录F holo-Nb26的主链化学位移归属结果
致谢
作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果



本文编号：3751643

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