遗传编码核糖核酸生物传感新方法研究
发布时间：2023-03-26 20:12
荧光染料特异性结合核糖核酸(RNA)适配体发光作为生物传感的新方法,是近年来分析化学和生命科学交叉领域的一个重要突破。人们把这种发光的核糖核酸-染料复合物,称之为“点亮”探针。此类探针不仅仅可用于体外目标物的检测,比如环境中的重金属、细胞提取物中的代谢小分子、重要的功能蛋白,它还可作为一个类似绿色荧光蛋白(GFP)的“标签”分子,被广泛应用于活细胞荧光成像,对细胞内目标RNA分子进行示踪、动力学研究及细胞成分的定量研究,这类“标签”分子主要以“Spinach”(菠菜)为代表。除此之外,还有黄酰罗丹明B-适配体复合物,作为生物传感器点亮探针应用在原核生物中,连有二硝基氟苯的黄酰罗丹明B共轭物在没有结合适配体的时候,处于荧光猝灭的状态,当与适配体结合后,由于空间构象变化,使荧光团与猝灭基团分开,从而导致荧光团重新恢复荧光。点亮核糖核酸适配体,不仅可以通过体外合成方法得到,还可以通过基因工程在活细胞内编码而成。它主要是利用宿主细胞本身的遗传调控机制,将人为设计拼接好的标准化基因模块表达出来,产物不仅仅是RNA适配体序列,也可以是蛋白分子。通过构建各种不同的质粒载体,在活细胞中表达出RNA适配...
【文章页数】：149 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 绪论
1.1 核酸适配体概述
1.2 荧光团-核糖核酸适配体“点亮”型生物传感器
1.2.1 点亮核糖核酸适配体筛选
1.2.2 点亮核糖核酸适配体选择激活的染料荧光团种类
1.2.3 工作原理
1.2.4 荧光团-核糖核酸适配体生物传感器用于体外检测的应用
1.2.5 荧光团-核糖核酸适配体传感器用于细胞内成像应用
1.3 基于“点亮”型荧光团-核糖核酸传感器在CRISPR技术中应用
1.3.1 II型CRISPR简介
1.3.2 点亮RNA适配体-荧光团的应用
1.4 本论文研究的构想
第2章 体外转录RNA适配体生物传感器免标记多重检测miRNA分子
2.1 前言
2.2 实验部分
2.2.1 试剂与仪器
2.2.2 DNA-RNA杂交形成Splint连接反应体系
2.2.3 T7核糖核酸聚合酶体外转录
2.2.4 琼脂糖凝胶电泳分析
2.2.5 核糖核酸适体传感器检测miRNA的荧光测定
2.2.6 细胞培养及样品制备
2.2.7 RT-PCR定量检测不同细胞内miRNA21及miRNA141表达水平
2.3 结果与讨论
2.3.1 实验设计原理
2.3.2 分析方法体外响应验证
2.3.3 凝胶电泳分析
2.3.4 传感器对不同浓度目标物的光谱曲线的测定
2.3.5 分析方法的选择性研究
2.3.6 适体传感器对细胞中总microRNA的测定
2.4 小结
第3章 基于“邻近效应”体外转录产生适配体生物传感器检测前列腺特异性抗原分子
3.1 前言
3.2 实验部分
3.2.1 试剂与仪器
3.2.2 抗体标记的DNA探针的制备
3.2.3 PSA邻近连接反应体系
3.2.4 体外转录RNA适配体
3.2.5 荧光测定
3.2.6 琼脂糖凝胶电泳分析
3.2.7 ELISA检测
3.2.8 荧光定量PCR检测
3.3 结果与讨论
3.3.1 实验设计原理
3.3.2 探针制备
3.3.3 分析方法的体外验证
3.3.4 实验条件的优化
3.3.5 生物传感器检测PSA
3.3.6 传感器特异性研究
3.3.7 血液中PSA的测定
3.4 小结
第4章 遗传编码RNA适配体生物传感器用于活细胞内miR分子的比率型成像研究
4.1 前言
4.2 实验部分
4.2.1 试剂与仪器
4.2.2 黄酰罗丹明B-(PEG)3-二硝基氟苯共轭物的合成
4.2.3 质粒构建
4.2.4 RNA适体传感器的体外转录
4.2.5 RNA适体传感器的体外分析
4.2.6 琼脂糖凝胶电泳分析
4.2.7 细胞培养和转染
4.2.8 细胞成像
4.2.9 荧光定量PCR检测RNA适体
4.2.10 荧光定量PCR检测miRNA
4.3 结果与讨论
4.3.1 实验设计原理
4.3.2 黄酰罗丹B-二硝基氟苯(SR-DN)共轭物的合成与其在细胞中渗透性研究
4.3.3 适体生物传感器的体外优化与合成
4.3.4 适体生物传感器的体外响应实验
4.3.5 质粒转染细胞成像
4.3.6 实时定量PCR分析细胞内生物传感器的表达水平
4.3.7 质粒构建与表征
4.3.8 细胞共聚焦成像
4.4 小结
第5章 单启动子驱动鲁棒比率型内标和RNA适配体生物传感器用于活细胞内mRNA分子的定量分析
5.1 前言
5.2 实验部分
5.2.1 试剂与仪器
5.2.2 质粒构建
5.2.3 RNA适体传感器的体外转录
5.2.4 RNA适体传感器的体外分析
5.2.5 琼脂糖凝胶电泳分析
5.2.6 细胞培养和转染
5.2.7 细胞成像
5.2.8 荧光定量PCR检测GFP和适配体RNA
5.2.9 RNA标准曲线的建立
5.2.10 mRNA绝对定量检测
5.3 结果与讨论
5.3.1 实验设计原理
5.3.2 质粒构建示意图
5.3.3 质粒构建与表征
5.3.4 带有鲁棒内标的核酸适体质粒转染后细胞成像
5.3.5 实时定量PCR检测RNA元件的表达
5.3.6 适体传感器的体外响应实验
5.3.7 传感器的体内响应实验
5.3.8 细胞内mRNA拷贝数标准曲线的建立
5.3.9 ROI荧光标准曲线的建立
5.3.10 不同细胞系mRNA定量研究
5.4 小结
第6章 基于CRISPR体系转录激活点亮RNA适配体用于活细胞内mRNA分子成像研究
6.1 前言
6.2 实验部分
6.2.1 实验试剂
6.2.2 体外转录gRNA
6.2.3 DNA体外切割实验
6.2.4 琼脂糖凝胶电泳分析
6.2.5 质粒构建
6.2.6 细胞培养和转染
6.2.7 细胞成像
6.2.8 RT-PCR检测细胞内适配体的表达
6.2.9 RT-PCR检测细胞内mRNA的表达
6.3 结果与讨论
6.3.1 工作原理
6.3.2 质粒表征
6.3.3 质粒DNA体外酶切验证
6.3.4 细胞内RNA分子激活成像
6.3.5 药物处理后细胞成像及RT-PCR
6.4 小结
结论
参考文献
附录A 攻读学位期间发表的学术论文目录
致谢
本文编号：3771643
【文章页数】：149 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 绪论
1.1 核酸适配体概述
1.2 荧光团-核糖核酸适配体“点亮”型生物传感器
1.2.1 点亮核糖核酸适配体筛选
1.2.2 点亮核糖核酸适配体选择激活的染料荧光团种类
1.2.3 工作原理
1.2.4 荧光团-核糖核酸适配体生物传感器用于体外检测的应用
1.2.5 荧光团-核糖核酸适配体传感器用于细胞内成像应用
1.3 基于“点亮”型荧光团-核糖核酸传感器在CRISPR技术中应用
1.3.1 II型CRISPR简介
1.3.2 点亮RNA适配体-荧光团的应用
1.4 本论文研究的构想
第2章 体外转录RNA适配体生物传感器免标记多重检测miRNA分子
2.1 前言
2.2 实验部分
2.2.1 试剂与仪器
2.2.2 DNA-RNA杂交形成Splint连接反应体系
2.2.3 T7核糖核酸聚合酶体外转录
2.2.4 琼脂糖凝胶电泳分析
2.2.5 核糖核酸适体传感器检测miRNA的荧光测定
2.2.6 细胞培养及样品制备
2.2.7 RT-PCR定量检测不同细胞内miRNA21及miRNA141表达水平
2.3 结果与讨论
2.3.1 实验设计原理
2.3.2 分析方法体外响应验证
2.3.3 凝胶电泳分析
2.3.4 传感器对不同浓度目标物的光谱曲线的测定
2.3.5 分析方法的选择性研究
2.3.6 适体传感器对细胞中总microRNA的测定
2.4 小结
第3章 基于“邻近效应”体外转录产生适配体生物传感器检测前列腺特异性抗原分子
3.1 前言
3.2 实验部分
3.2.1 试剂与仪器
3.2.2 抗体标记的DNA探针的制备
3.2.3 PSA邻近连接反应体系
3.2.4 体外转录RNA适配体
3.2.5 荧光测定
3.2.6 琼脂糖凝胶电泳分析
3.2.7 ELISA检测
3.2.8 荧光定量PCR检测
3.3 结果与讨论
3.3.1 实验设计原理
3.3.2 探针制备
3.3.3 分析方法的体外验证
3.3.4 实验条件的优化
3.3.5 生物传感器检测PSA
3.3.6 传感器特异性研究
3.3.7 血液中PSA的测定
3.4 小结
第4章 遗传编码RNA适配体生物传感器用于活细胞内miR分子的比率型成像研究
4.1 前言
4.2 实验部分
4.2.1 试剂与仪器
4.2.2 黄酰罗丹明B-(PEG)3-二硝基氟苯共轭物的合成
4.2.3 质粒构建
4.2.4 RNA适体传感器的体外转录
4.2.5 RNA适体传感器的体外分析
4.2.6 琼脂糖凝胶电泳分析
4.2.7 细胞培养和转染
4.2.8 细胞成像
4.2.9 荧光定量PCR检测RNA适体
4.2.10 荧光定量PCR检测miRNA
4.3 结果与讨论
4.3.1 实验设计原理
4.3.2 黄酰罗丹B-二硝基氟苯(SR-DN)共轭物的合成与其在细胞中渗透性研究
4.3.3 适体生物传感器的体外优化与合成
4.3.4 适体生物传感器的体外响应实验
4.3.5 质粒转染细胞成像
4.3.6 实时定量PCR分析细胞内生物传感器的表达水平
4.3.7 质粒构建与表征
4.3.8 细胞共聚焦成像
4.4 小结
第5章 单启动子驱动鲁棒比率型内标和RNA适配体生物传感器用于活细胞内mRNA分子的定量分析
5.1 前言
5.2 实验部分
5.2.1 试剂与仪器
5.2.2 质粒构建
5.2.3 RNA适体传感器的体外转录
5.2.4 RNA适体传感器的体外分析
5.2.5 琼脂糖凝胶电泳分析
5.2.6 细胞培养和转染
5.2.7 细胞成像
5.2.8 荧光定量PCR检测GFP和适配体RNA
5.2.9 RNA标准曲线的建立
5.2.10 mRNA绝对定量检测
5.3 结果与讨论
5.3.1 实验设计原理
5.3.2 质粒构建示意图
5.3.3 质粒构建与表征
5.3.4 带有鲁棒内标的核酸适体质粒转染后细胞成像
5.3.5 实时定量PCR检测RNA元件的表达
5.3.6 适体传感器的体外响应实验
5.3.7 传感器的体内响应实验
5.3.8 细胞内mRNA拷贝数标准曲线的建立
5.3.9 ROI荧光标准曲线的建立
5.3.10 不同细胞系mRNA定量研究
5.4 小结
第6章 基于CRISPR体系转录激活点亮RNA适配体用于活细胞内mRNA分子成像研究
6.1 前言
6.2 实验部分
6.2.1 实验试剂
6.2.2 体外转录gRNA
6.2.3 DNA体外切割实验
6.2.4 琼脂糖凝胶电泳分析
6.2.5 质粒构建
6.2.6 细胞培养和转染
6.2.7 细胞成像
6.2.8 RT-PCR检测细胞内适配体的表达
6.2.9 RT-PCR检测细胞内mRNA的表达
6.3 结果与讨论
6.3.1 工作原理
6.3.2 质粒表征
6.3.3 质粒DNA体外酶切验证
6.3.4 细胞内RNA分子激活成像
6.3.5 药物处理后细胞成像及RT-PCR
6.4 小结
结论
参考文献
附录A 攻读学位期间发表的学术论文目录
致谢
本文编号：3771643
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