Bacillus sp.FJAT-44876γ-环糊精葡萄糖基转移酶的表征及热稳定性提升研究

发布时间：2023-04-02 03:10

　　环糊精(Cyclodextrins,CDs)是指由6个及以上葡萄糖单元通过α-1,4-糖苷键首尾相连形成的低聚糖化合物。常见的CD中,γ-CD因具有空腔大、溶解性好、安全性高的特质,在食品、医药、生物等领域应用前景广阔,其主要利用γ-环糊精葡萄糖基转移酶(γ-Cyclodextrin Glycosyltransferase,γ-CGTase)的环化活力转化淀粉而生成。目前,已报道的γ-CGTase存在种类较少且热稳定性差的问题,无法满足淀粉底物糊化状态下的催化需求,因此发掘新型γ-CGTase并提高其热稳定性对推动γ-CD生产具有重要的现实意义。本课题以来源于Bacillus sp.FJAT-44876的γ-CGTase为研究对象,探究了其酶学性质,并通过Ca²⁺及定点突变进一步提高其热稳定性,旨在为γ-CGTase热稳定性基础研究提供参考和γ-CD生产提供新的选择。通过序列比对、克隆表达、分离纯化,得到一个具有高热稳定性潜质的新型γ-CGTase并对其进行酶学性质研究。将其克隆表达后,利用镍亲和层析进行分离纯化以及SDS-PAGE进一步验证。结果显示,电泳图谱中...

【文章页数】：64 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩写符号说明
1 绪论
    1.1 γ-环糊精(γ-CD)概述
        1.1.1 γ-CD的结构及性质
        1.1.2 γ-CD的应用
        1.1.3 γ-CD的制备
    1.2 γ-环糊精葡萄糖基转移酶(γ-CGTase)概述
        1.2.1 γ-CGTase的来源
        1.2.2 γ-CGTase的结构与功能
        1.2.3 γ-CGTase的催化反应机理
        1.2.4 CGTase的应用
        1.2.5 γ-CGTase的研究现状
    1.3 酶热稳定性提高策略及其在CGTase中应用
        1.3.1 酶热稳定性提高策略概述
        1.3.2 CGTase热稳定性研究概况
    1.4 立题依据及意义
    1.5 主要研究内容
2 材料与方法
    2.1 实验材料与仪器
        2.1.1 菌株及质粒
        2.1.2 实验试剂
        2.1.3 实验仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 γ-CGTase基因挖掘及克隆表达
        2.2.2 重组γ-CGTase的菌体培养
        2.2.3 重组γ-CGTase的分离纯化
        2.2.4 SDS-PAGE凝胶电泳
        2.2.5 蛋白浓度的测定
        2.2.6 重组γ-CGTase环化活力的测定
        2.2.7 重组γ-CGTase的定性分析
        2.2.8 重组γ-CGTase酶学性质的测定
        2.2.9 Ca²⁺浓度对重组γ-CGTase的影响
        2.2.10 内源荧光性的测定
        2.2.11 差示扫描微量热分析(Nano DSC)
        2.2.12 同源建模分析
        2.2.13 不同因素对γ-CD制备的影响
        2.2.14 高效液相色谱(HPLC)
        2.2.15 超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS)
        2.2.16 突变体的构建
        2.2.17 突变体的表达及性质鉴定
        2.2.18 突变体的热稳定性分析
        2.2.19 数据处理
3 结果与讨论
    3.1 重组γ-CGTase克隆表达及酶学性质表征
        3.1.1 γ-CGTase生物信息学的分析
        3.1.2 重组蛋白质的分离纯化
        3.1.3 重组γ-CGTase的定性分析
        3.1.4 重组γ-CGTase酶学性质的测定
    3.2 Ca²⁺对γ-CGTase热稳定性的影响
        3.2.1 Ca²⁺浓度对重组γ-CGTase环化活力的影响
        3.2.2 Ca²⁺浓度对重组γ-CGTase热稳定性的影响
        3.2.3 Ca²⁺提高重组γ-CGTase热稳定性的机理分析
        3.2.4 不同因素对γ-CD制备的影响
    3.3 定点突变对热稳定性的影响
        3.3.1 突变点的选择
        3.3.2 突变体的分离纯化
        3.3.3 突变体的定性分析
        3.3.4 突变体最适温度及热稳定性的测定
        3.3.5 突变体热稳定性的分析
主要结论与展望
    主要结论
    展望
致谢
参考文献
附录1
附录2 :作者在攻读硕士学位期间发表的论文



本文编号：3778413