DNA磷酸化及T4多聚核苷酸激酶的纳米孔单分子检测研究

发布时间：2023-04-02 06:57

　　暴露于环境毒物和压力源、辐射、药物、炎症、细胞呼吸以及常规DNA代谢都会导致细胞毒性DNA链断裂的产生,DNA链断裂后通常缺少DNA合成和DNA连接所需的5’-磷酸和3’-羟基的部分。如果不能解决DNA末端的损伤,会导致DNA复制和修复异常,造成基因组不稳定性、诱变、神经疾病、衰老以及癌的发生。T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)是生物体内常见的激酶之一,具有5’-激酶和3’-磷酸酶活性。该酶的5’-激酶活性能够催化ATP的γ-磷酸转移到多核苷酸的5’-羟基末端,是修复生物体基因损伤的重要生物酶。传统上多采用放射性同位素³²P-标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影测定DNA的磷酸化和T4 PNK活性。这些方法过程繁琐、耗时费力且放射性标记会引起健康问题。近年来,纳米孔单分子技术因其具有免标记、高通量、低成本等优势而迅速成为分析化学领域极具潜力的检测手段。本文以α-溶血素(α-hemolysin,α-HL)蛋白质纳米孔为传感元件,设计使用发夹结构的DNA,实现了DNA磷酸化和T4多聚核苷酸激酶的单分子检测分析。本论文主要研究内容如下:1、文献综述本章简要综述了单分子技...

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 单分子分析技术的研究进展
    1.2 纳米孔单分子分析技术的研究进展
        1.2.1 纳米孔单分子技术的检测原理
        1.2.2 纳米孔的分类
    1.3 α-溶血素纳米孔简介
    1.4 α-溶血素纳米孔在检测基因表观遗传修饰方面的应用
        1.4.1 DNA甲基化的检测
        1.4.2 DNA损伤的检测
        1.4.3 Micro RNA的检测
        1.4.4 G-四链体及其折叠过程的检测
    1.5 α-溶血素纳米孔在单分子酶反应研究方面的应用
    1.6 T4多聚核苷酸激酶
        1.6.1 T4PNK简介
        1.6.2 T4PNK活性的检测以及抑制剂的筛选
    1.7 本课题的研究意义
    参考文献
第二章 基于α-HL纳米孔单分子技术对DNA磷酸化的检测
    2.1 前言
    2.2 实验部分
        2.2.1 实验试剂
        2.2.2 实验仪器
        2.2.3 实验装置
        2.2.4 电解池和电极的制备
        2.2.5 磷脂双分子层的形成
        2.2.6 天然α-HL蛋白质(WT)7的制备
        2.2.7 DNA序列
        2.2.8 溶液的配制
        2.2.9 单通道电流记录及数据处理
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 α-HL(WT)7纳米通道检测5'-磷酸化与未磷酸化的发夹DNA
        2.3.2 电压对发夹DNA穿孔信号的影响
        2.3.3 盐浓度对发夹DNA穿孔信号的影响
        2.3.4 发夹DNA茎部的碱基配对数对5'-磷酸化检测的影响
        2.3.5 3 '-磷酸化对发夹DNA结构的影响
        2.3.6 5 '-磷酸化与3'-磷酸化对发夹DNA结构影响的综合对比
        2.3.7 5'-磷酸化对发夹DNA与 Dox结合的影响
    2.4 结论
    参考文献
第三章 基于纳米孔单分子技术检测T4多聚核苷酸激酶活性
    3.1 前言
    3.2 实验部分
        3.2.1 实验试剂
        3.2.2 实验仪器
        3.2.3 电解池和电极的准备
        3.2.4 磷脂双分子层的形成
        3.2.5 天然α-HL蛋白质(WT)7的制备
        3.2.6 溶液的配制
        3.2.7 DNA序列
        3.2.8 实验步骤
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 检测原理分析
        3.3.2 实验方法的可行性研究
        3.3.3 T4PNK活性分析
        3.3.4 分析方法的选择性研究
        3.3.5 实际样本的检测
        3.3.6 T4PNK激酶抑制剂分析
    3.4 结论
    参考文献
结论
攻读硕士学位期间取得的科研成果
致谢



本文编号：3778775