电化学方法对DNA和外泌体的检测

发布时间：2023-08-15 19:59

　　近年来,癌症已经成为危及人类健康的主要原因之一。研究人员花费大量时间对癌症进行灵敏而精确的诊断。DNA分子作为遗传物质,参与各种生物体的生存发育,指导机体各项生命活动的运作。因此,DNA分子的灵敏分析对于癌症诊断、环境监测和预后治疗等方面都有着重大的意义。它也是现代分析化学的一项主要研究课题。另一方面,由于肿瘤相关的外泌体有助于肿瘤的转移、发展和免疫调节,且外泌体在体液中相对丰富、采集标本时侵袭性小,这使得外泌体在癌症液体活检方面具有巨大的潜力。因此本文主要探究了外切酶作用下电化学检测DNA和靶向触发3D DNA walker对外泌体的超灵敏检测。(1)准确、灵敏的DNA分析是了解DNA功能和疾病早期诊断的基础。因此,本实验构建了λ外切酶(λ-Exo)作用下的电化学传感器来检测靶标DNA(tDNA)。在目标DNA存在下,λ-Exo作用于5’磷酸化的双链DNA,沿5’→3’方向逐步切去5’单核苷酸。因此,二茂铁标记的DNA链可以通过杂交引入到金电极表面,实现电化学信号的增加。本工作进行了λ-Exo用量和反应时间的优化。采用电化学阻抗谱法对其组装过程进行了表征。在优化条件下,tDNA可以实...

【文章页数】：83 页

【学位级别】：硕士

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摘要
abstract
第一章 前言
    1.1 基于信号放大的多种超灵敏生物传感器的构建
        1.1.1 外切酶辅助的生物传感器的构建
        1.1.2 DNA酶辅助的生物传感器的构建
        1.1.3 DNA步行器辅助的生物传感器的构建
        1.1.4 比率法生物传感器的构建
    1.2 电化学DNA生物传感器
        1.2.1 电化学DNA生物传感器的概述
        1.2.2 DNA探针固定方法
            1.2.2.1 吸附结合法
            1.2.2.2 共价固定法
            1.2.2.3 自组装法
            1.2.2.4 化学免疫法
        1.2.3 电化学检测技术
            1.2.3.1 循环伏安法
            1.2.3.2 交流阻抗法
            1.2.3.3 差分脉冲伏安法
    1.3 外泌体
        1.3.1 外泌体简介
        1.3.2 外泌体的发展史
        1.3.3 外泌体的组成成分
        1.3.4 外泌体的分离方式
            1.3.4.1 超速离心法
            1.3.4.2 试剂盒提取法
            1.3.4.3 超滤离心法
            1.3.4.4 体积排阻层析分离法
            1.3.4.5 PEG沉淀法
            1.3.4.6 磁珠免疫法
        1.3.5 外泌体的表征及检测方法
            1.3.5.1 外泌体的主要表征方式
            1.3.5.2 外泌体的主要检测方法
        1.3.6 外泌体的应用
            1.3.6.1 外泌体作为早期癌症检测的新生物标志物
            1.3.6.2 外泌体作为纳米载体进行药物递送和癌症治疗
    1.4 主要外泌体表面标志物
        1.4.1 CD63
        1.4.2 上皮细胞黏附分子(EpCAM)
    1.5 本论文的选题背景和主要内容
第二章 外切酶作用下电化学检测DNA
    2.1 引言
    2.2 实验部分
        2.2.1 仪器与试剂
        2.2.2 实验步骤
            2.2.2.1 配制10 m M PBS(p H=7.4)缓冲溶液
            2.2.2.2 配制Tris-HCl(10 m M,p H=7.4)缓冲溶液
            2.2.2.3 电极预处理
            2.2.2.4 hDNA预处理
            2.2.2.5 组装金电极并对tDNA进行电化学检测
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 实验原理
        2.3.2 实验可行性分析
        2.3.3 电极修饰的表征
        2.3.4 实验条件优化
        2.3.5 对tDNA的灵敏度检测
        2.3.6 复杂体系检测
    2.4 本章小结
第三章 目标触发三维DNA步行器和核酸外切酶Ⅲ辅助的电化学比率生物传感器对外泌体超灵敏检测
    3.1 引言
    3.2 实验部分
        3.2.1 仪器与试剂
        3.2.2 实验步骤
            3.2.2.1 细胞培养所需溶液配制
            3.2.2.2 细胞培养具体步骤
            3.2.2.3 超速离心法分离外泌体
            3.2.2.4 人血浆中分离外泌体
            3.2.2.5 外泌体透射电镜
            3.2.2.6 外泌体的免疫蛋白印记
            3.2.2.7 生物素链与链霉亲和素修饰磁珠的偶联
            3.2.2.8 DNA步行器的制备
            3.2.2.9 验证目标触发的DNA酶步行器
            3.2.2.10 聚丙烯酰胺凝胶电泳表征
            3.2.2.11 电化学检测
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 实验原理
        3.3.2 外泌体的表征
        3.3.3 实验可行性验证
            3.3.3.1 DNA与磁珠的特异性识别验证
            3.3.3.2 目标触发DNA酶步行器的可行性验证
            3.3.3.3 电化学比率法的可行性验证
        3.3.4 电极修饰的表征
        3.3.5 实验条件的优化
        3.3.6 MCF-7细胞分泌外泌体的检测
        3.3.7 传感器选择性检测
        3.3.8 复杂生物样品中外泌体的检测
    3.4 本章小结
结论
参考文献
致谢
攻读硕士期间发表的论文



本文编号：3842178