基于两种荧光探针研究乙酰胆碱酯酶的活性及其抑制作用

发布时间：2017-05-21 19:21

  本文关键词：基于两种荧光探针研究乙酰胆碱酯酶的活性及其抑制作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)作为一种存在于神经系统中的水解酶,主要是通过水解神经递质乙酰胆碱(AChE),终止神经冲动的传递。荧光探针具有优良的物理化学性能,因其具有特定的检测基团,所以能选择性和特异性的对物质进行分析检测。由于荧光具有高灵敏、高选择性、操作简单等优势,使其在检测方面受到越来越多的青睐。本论文研究了荧光探针在生物体中农药残留检测的应用。我们合成了两种新型的1,8-萘酰亚胺类硼酸探针和硝基探针,对这2种探针采用红外、紫外可见光谱、荧光和核磁分析等手段进行了结构表征,重点介绍了基于这两种荧光探针研究与乙酰胆碱酯酶活性有关的相关物质(乙酰胆碱和有机磷农药),从而实现高效、特异性的检测乙酰胆碱和农药残留。主要内容如下:1)合成一种新型的荧光探针(4-硼酸-N-丁基-1,8萘酰亚胺,BN),基于酶解产生双氧水提出一种新型的高灵敏度和高选择性的检测乙酰胆碱的荧光方法。检测原理如下:乙酰胆碱在乙酰胆碱酯酶的作用下生成胆碱,随后胆碱在胆碱氧化酶的作用下得到双氧水。酶解产生的双氧水和探针BN反应,导致BN的硼酸部分水解脱保护生成一种荧光产物(4-羟基-N-丁基-1,8萘酰亚胺,ON)。此方法检测乙酰胆碱具有良好的检测范围(0.01-80μM,R2=0.9961)和较低的检测限2.7 nM。与其他检测双氧水的探针采用非特异性氧化原理不同,BN采用水解脱保护的原理能很好的避免其他活性氧(ROS)的干扰。本文提供了一种新的荧光方法检测乙酰胆碱,此方法具有很高的选择性和灵敏度。2)因为农药抑制AChE的活性,利用上述探针BN,实现超灵敏荧光检测农药。实验中乙酰胆碱酯酶催化乙酰胆碱产生胆碱,胆碱被胆碱氧化酶氧化生成双氧水,双氧水与探针结合生成荧光类产物ON。当加入农药时,乙酰胆碱酯酶的活性被抑制,使酶产生的双氧水减少,引起少量的荧光增强。通过检测BN的荧光变化,农药对乙酰胆碱酯酶的抑制被检测。实验表明,农药对乙酰胆碱酯酶的抑制率与农药浓度的对数成正比。通过研究农药对乙酰胆碱酯酶的抑制,本论文实现了对甲拌磷,甲基对硫磷和乙酰甲胺磷的高灵敏度检测,其检测限分别为2.31×10-7,3.46×10-8,9.92×10-7 g/L。本实验提供了一种新的灵敏检测农药的方法,该方法对农药残留的研究应用具有广阔前景。3)提出了一种新型的高效检测有机磷农药的方法。本文合成了一种新型的硝基探针,此探针对巯基类物质有良好的响应。基于有机磷农药能够抑制乙酰胆碱酯酶的活性,有效阻碍乙酰胆碱酯酶对硫代乙酰胆碱的水解,从而产生少量的硫代胆碱。产生的硫代胆碱能使此硝基探针的荧光增加,荧光强度的变化与农药含量成反比关系。运用此方法,我们成功检测了甲基对硫磷,甲伴磷和乙酰甲胺磷,他们的检测限分别为3.12×10-10,3.20×10-9和3.04×10-9 g/L。实验证明此方法测量的结果与高效液相色谱法相同。我们相信此方法能提供另一种良好的检测有机磷农药的策略。
【关键词】：荧光探针 1 8-萘酰亚胺 硼酸探针 硝基探针 乙酰胆碱
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q55;O657.3
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 第一章 文献综述11-24
• 1.1 研究背景11-12
• 1.2 乙酰胆碱酯酶12-15
• 1.2.1 生物体内乙酰胆碱酯酶的生理意义12
• 1.2.2 乙酰胆碱酯酶的分子形式12-13
• 1.2.3 乙酰胆碱酯酶的结构13
• 1.2.4 乙酰胆碱酯酶相关物质13-15
• 1.3 荧光探针在乙酰胆碱酯酶的活性检测与抑制中的应用15-24
• 1.3.1 乙酰胆碱酯酶相关物质的检测方法15-18
• 1.3.2 荧光检测18-19
• 1.3.3 荧光探针19
• 1.3.4 荧光探针的组成部分19
• 1.3.5 1,8-萘酰亚胺类荧光染料的背景介绍19-20
• 1.3.6 基于硼酸酯为识别基团的探针介绍20-24
• 第二章 基于硼酸探针的检测乙酰胆碱24-37
• 2.1 前言24-25
• 2.2 实验部分25-27
• 2.2.1 实验试剂和仪器25-26
• 2.2.2 4-溴-N-正丁基-1,8-萘酰亚胺的合成26
• 2.2.3 4-硼酸-N-正丁基-1,8-萘酰亚胺的合成26
• 2.2.4 荧光检测乙酰胆碱26
• 2.2.5 荧光检测血液中的乙酰胆碱26-27
• 2.3 结果与讨论27-36
• 2.3.1 探针的光谱性质27-30
• 2.3.2 检测乙酰胆碱的机理30-31
• 2.3.3 探针对酶的影响31
• 2.3.4 检测条件的优化31-34
• 2.3.5 乙酰胆碱的检测34
• 2.3.6 选择性研究34-35
• 2.3.7 检测血液中的乙酰胆碱35-36
• 2.4 本章小结36-37
• 第三章 基于一种新的硼酸探针超灵敏检测农药的研究37-52
• 3.1 前言37-39
• 3.2 实验部分39-42
• 3.2.1 材料与仪器39
• 3.2.2 4-溴-N-丁基-1,8-萘酰亚胺的合成39-42
• 3.2.3 农药的荧光检测42
• 3.2.4 实际样品检测42
• 3.3 结论与讨论42-51
• 3.3.1 探针的光谱性质42-43
• 3.3.2 检测农药的机理43-44
• 3.3.3 探针对酶活的影响44-45
• 3.3.4 条件优化45-48
• 3.3.5 有机磷农药的检测48-49
• 3.3.6 选择性考察49-50
• 3.3.7 实际样品考察50-51
• 3.4 结论51-52
• 第四章 硝基探针高效检测有机磷农药52-64
• 4.1 前言52-53
• 4.2 实验部分53-56
• 4.2.1 材料与仪器53-54
• 4.2.2 探针NN的合成54-56
• 4.2.3 探针NN荧光检测56
• 4.2.4 实际样品的检测56
• 4.3 实验结果与讨论56-63
• 4.4 本章小结63-64
• 第五章 结论与展望64-66
• 5.1 结论64-65
• 5.2 展望65-66
• 参考文献66-72
• 研究生期间发表的论文和专利72-73
• 致谢73-74

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