抗苏丹红Ⅰ/吖啶酯的双特异性抗体的构建与免疫化学发光方法的研究

发布时间：2023-11-20 19:44

　　本文主要研究双特异性抗体在免疫发光分析方法学领域的应用。利用苏丹红I作为模式分析物,分别采用异源双功能交联剂化学偶联法和杂交-杂交瘤细胞融合方法构建了两种抗苏丹红I/抗发光底物的双特异性抗体,利用构建的抗体可以同时特异性地与发光底物和苏丹红Ⅰ的结合特性,建立了基于该双特异性抗体的免疫发光分析方法。1.异源双功能交联剂化学偶联法构建双特异性抗体采用二硫苏糖醇(DTT)还原抗体重链与重链之间的二硫键形成游离的巯基,采用正交试验设计法优化反应条件,由实验结果得出:反应pH对重链与轻链(HC-LC)的产率影响最为显著,其次是温度和浓度,反应时间的影响次之。最优反应条件如下:pH为7⁸之间,浓度为1mg/mL,温度为25℃,时间2h,投料摩尔比例n(DTT):n(IgG)为30⁷0。利用异源双功能交联剂4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sulfo-SMCC)先连接抗吖啶酯的单克隆抗体,后与还原二硫键的抗苏丹红I抗体进行偶联,经非还原SDS-PAGE检测,双特异性抗体偶联成功。2.杂交-杂交瘤细胞融合方法构建双特异性抗体采...

【文章页数】：85 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第1章 绪论
    1.1 免疫发光分析方法
        1.1.1 酶联免疫发光分析方法
        1.1.2 化学标记免疫发光分析方法
    1.2 双特异性抗体构建的方法
        1.2.1 化学偶联方法
        1.2.2 基因重组方法
        1.2.3 细胞融合方法
    1.3 双特异性抗体应用
        1.3.1 双特异性抗体在医药学中的应用
        1.3.2 双特异性抗体在免疫学检测中的应用
    1.4 双特异性抗体的纯化
    1.5 本文的研究目的和主要内容
第2章 化学偶联法构建双特异性抗体的研究
    2.1 设备与材料
        2.1.1 主要试剂
        2.1.2 实验所用溶液配制
        2.1.3 主要仪器
    2.2 实验方法与过程
        2.2.1 抗 Sudan I 抗体与抗吖啶酯抗体的纯化
            2.2.1.1 辛酸-硫酸铵法提纯抗体
            2.2.1.2 Protein G免疫亲和柱纯化抗体
            2.2.1.3 抗Sudan Ⅰ和抗吖啶酯单克隆抗体的纯度检测
            2.2.1.4 抗Sudan Ⅰ和抗吖啶酯单克隆抗体的活性检测
        2.2.2 DTT还原二硫键的最佳条件研究
            2.2.2.1 还原反应条件的正交试验
            2.2.2.2 抗体与DTT的反应摩尔比的优化
            2.2.2.3 ELISA检测还原二硫键后的抗体活性
        2.2.3 双特异性抗体的化学偶联
            2.2.3.1 Sulfo-SMCC与抗吖啶酯抗体的反应摩尔比例优化
            2.2.3.2 抗苏丹红/吖啶酯的双特异性抗体的制备
        2.2.4 SDS-PAGE凝胶电泳鉴定双特异性抗体
        2.2.5 化学发光法检测双特异性抗体
            2.2.5.1 偶联吖啶酯发光底物的准备
            2.2.5.2 双特异性抗体发光检测
    2.3 实验结果与分析
        2.3.1 单克隆抗体的纯化与活性检测
        2.3.2 DTT还原二硫键的最佳条件优化
            2.3.2.1 还原反应条件的优化
            2.3.2.2 抗体与DTT的摩尔比例的优化
            2.3.2.3 ELISA检测还原抗体的活性
        2.3.3 Sulfo-SMCC与抗吖啶酯抗体反应的摩尔比例
        2.3.4 双特异性抗体偶联的结果
        2.3.5 化学发光方法检测双特异性抗体
            2.3.5.1 吖啶酯偶联物的选择
            2.3.5.2 双特异性抗体的发光检测
    2.4 实验小结
第3章 细胞融合法制备双特异性抗体
    3.1 实验设备与材料
        3.1.1 实验动物和细胞
        3.1.2 实验主要试剂
        3.1.3 主要实验仪器
        3.1.4 溶液的配制方法
    3.2 实验部分
        3.2.1 小鼠的免疫过程
        3.2.2 小鼠血清效价的检测
        3.2.3 血清特异性检测
        3.2.4 细胞融合-
            3.2.4.1 抗苏丹红I杂交瘤细胞的缺陷细胞株的准备
            3.2.4.2 免疫的小鼠脾细胞准备
            3.2.4.3 电融合与三瘤细胞的培养
        3.2.5 双特异性的三瘤细胞筛选
        3.2.6 三瘤细胞克隆化过程
        3.2.7 双特异性抗体的生产
        3.2.8 抗原柱纯化双特异性抗体
            3.2.8.1 抗原柱的准备
            3.2.8.2 抗原柱缓冲条件的优化
            3.2.8.3 抗原柱的缓冲液pH与离子浓度的优化
        3.2.9 抗原柱纯化抗苏丹红I/吖啶酯的双特异性抗体
    3.3 实验结果和分析
        3.3.1 免疫小鼠的血清效价和特异性检测
        3.3.2 缺陷型细胞上清的效价与抑制效果检测
        3.3.3 三瘤杂交细胞的筛选
        3.3.4 三瘤杂交细胞的特异性检测
        3.3.5 抗原柱纯化抗苏丹红I/吖啶酯的双特异性抗体
            3.3.5.1 吖啶酯抗原柱的缓冲条件优化
            3.3.5.2 抗原柱缓冲液的pH与离子浓度的优化
            3.3.5.3 双特异性抗的浓度测定
    3.4 实验小结
第4章 基于双特异性抗体的免疫发光分析方法研究
    4.1 实验材料与设备
        4.1.1 主要试剂
        4.1.2 主要仪器
    4.2 实验方法
        4.2.1 双特异性抗体与单克隆抗体亲和力对比
        4.2.2 间接酶联免疫吸附(ELISA)法
        4.2.3 间接竞争ELISA法
        4.2.4 间接免疫发光分析方法
        4.2.5 间接竞争免疫发光分析方法
        4.2.6 发光反应体系的优化
            4.2.6.1 抗原浓度优化
            4.2.6.2 HRP-AE浓度优化
            4.2.6.3 抗体浓度优化
            4.2.6.4 标准品稀释液的优化
            4.2.6.5 缓冲液的pH优化
            4.2.6.6 缓冲液的离子浓度优化
            4.2.6.7 间接竞争CLEIA标准曲线的建立
        4.2.7 样品处理
    4.3 实验结果与分析
        4.3.1 双特异性抗体与单克隆抗体亲和力的比较
        4.3.2 双特异性抗体与单克隆抗体竞争效果的比较
            4.3.2.1 苏丹红-BSA包被和抗体浓度的确定
            4.3.2.2 吖啶酯-BSA包被和抗体浓度的确定
            4.3.2.3 双特异性抗体与单抗竞争效果的对比
        4.3.3 CLIA和 CLEIA的对比
        4.3.4 双特异性抗体的CLEIA条件优化
            4.3.4.1 抗原浓度的确定
            4.3.4.2 HRP-AE浓度确定
            4.3.4.3 抗体浓度确定
            4.3.4.4 标准品稀释液的优化
            4.3.4.5 缓冲液的pH确定
            4.3.4.6 缓冲液的离子浓度确定
            4.3.4.7 标准曲线的建立
        4.3.5 加标回收测定
    4.4 实验小结
第5章 总结与展望
参考文献
攻读学位期间的研究成果及所获荣誉
致谢



本文编号：3865717