双酚A单克隆抗体制备及胶体金免疫层析试纸条的研制

发布时间：2017-05-23 23:03

  本文关键词：双酚A单克隆抗体制备及胶体金免疫层析试纸条的研制，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：双酚A(bisphenol A,BPA)是由两分子苯酚和一分子丙酮在酸性条件下催化缩合而成的酚类物质,其结构与天然激素17-B雌激素及人工合成的雌激素相似,为EDCs中的一种,是已确定的外源性雌激素。双酚A是PC的重要原料,许多日常消费品如食品包装容器、婴儿奶瓶等儿童用品都可能含有双酚A,双酚A在加热时能析出,进入到食物和饮料当中。近两年来双酚A引起了人们的高度关注。 本文通过重氮法在双酚A中引入羧基,采用碳二亚胺法将双酚A半抗原与牛血清白蛋白进行偶联,合成双酚A免疫抗原,再采用混合酸酐法和卵清蛋白偶联得到包被抗原。用免疫抗原对BALB/c鼠进行免疫,经测定血清效价及特异性筛选有效免疫的小鼠。利用PEG法对小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合,筛选效价高,亲合力好细胞株,经3次有限稀释亚克隆后建立稳定的细胞株。通过体内诱生腹水制备大量单克隆抗体,收集腹水并采用辛酸-硫酸铵沉淀法进行纯化,SDS-PAGE和紫外分光光度法鉴定抗体纯度和含量。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,标记双酚A单克隆抗体,依据免疫层析技术研制检测双酚A残留的免疫层析快速检测试纸条。 实验结果：(1)经紫外扫描及SDS-PAGE鉴定成功合成了双酚A的人工免疫抗原及包被抗原,其中双酚A分子与BSA和OVA的偶联比分别为11：1和6.8：1。(2)获得稳定分泌抗双酚A抗体的杂交瘤细胞株,该抗体属于IgG2b亚型,轻链为K链。(3)用间接竞争ELISA检测双酚单克隆抗体的灵敏性,建立抑制标准曲线方程为y=15.851x-4.0353,线性相关系数R2=0.9903,64ng/m1-8192ng/ml之间有良好的线性,半抑制浓度IC5o为2567.22ng/ml。(4)交叉反应结果表明抗体对双酚A具有较好的特异性,与双酚酸的交叉率为9.6%,与其余结构类似物的交叉率小于0.01%。(5)用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,以金标双酚A单克隆抗体作为探针,将BPAH-OVA(检测线)和羊抗鼠IgG(质控线)分别包被在硝酸纤维素膜上,构建了间接竞争胶体金免疫层析检测体系(GICA)。标记探针中金溶胶最佳粒径为40nm,T线最佳包被抗原浓度为0.2μg/ml,C线上二抗浓度为0.2mg/ml,金标液的最佳稀释度为3倍稀释。(6)GICA目测检出限为1OOng/ml,检测时间为10-15min。试纸条对双酚酸、壬基酚、辛基酚等无交叉反应。 结论：本研究制备的双酚A单克隆抗体,特异性相对较高,双酚A免疫层析试纸条的研制为双酚A进行现场快速检测的进一步研究奠定了基础。
【关键词】：双酚A 单克隆抗体 胶体金 免疫层析试纸条
【学位授予单位】：广东工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：O621.3
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 目录8-16
• ~.略词表（Abbreviations)16-17
• 第一章 绪论17-26
• 1.1 双酚A概述17-20
• 1.1.1 双酚A的物理和化学性质17-18
• 1.1.2 双酚A的使用状况18
• 1.1.3 双酚A的危害性及安全性争议18-19
• 1.1.4 双酚A残留的检测19-20
• 1.2 胶体金免疫层析技术20-24
• 1.2.1 胶体金免疫层析技术的概况20-22
• 1.2.2 胶体金免疫层析技术的应用22-24
• 1.2.3 胶体金免疫层析技术的发展趋势24
• 1.3 本课题的意义及主要研究内容24-26
• 1.3.1 本课题的研究意义24-25
• 1.3.2 本课题的研究思路及内容25-26
• 第二章 双酚A人工抗原的制备与鉴定26-37
• 2.1 材料与方法26-27
• 2.1.1 材料与试剂26-27
• 2.1.2 常用溶液体系27
• 2.1.3 实验仪器27
• 2.2 实验方法27-30
• 2.2.1 双酚A免疫抗原的合成27-29
• 2.2.2 双酣A完全抗原的鉴定29-30
• 2.3 结果与分析30-34
• 2.3.1 完全抗原的紫外扫描30-32
• 2.3.2 半抗原以及完全抗原的红外光谱32-33
• 2.3.3 SDS-PAGE鉴定结果33-34
• 2.3.4 偶联比的测定结果34
• 2.4 讨论与小结34-37
• 2.4.1 本章小结34-35
• 2.4.2 讨论35-37
• 第三章 双酚A单克隆抗体的制备37-55
• 3.1 材料与试剂37-39
• 3.1.1 动物和细胞37
• 3.1.2 主要试剂和材料37-38
• 3.1.3 溶液系统38-39
• 3.1.4 实验仪器39
• 3.2 实验方法39-46
• 3.2.1 动物免疫39-40
• 3.2.2 免疫血清效价检测40
• 3.2.3 细胞融合40-41
• 3.2.4 杂交瘤的筛选及业克隆41-43
• 3.2.5 细胞的冻存及复苏43-44
• 3.2.6 腹水抗体的纯化与鉴定44
• 3.2.7 抗体含量的测定44-45
• 3.2.8 抗体亚型的鉴定45
• 3.2.9 纯化后抗体效价测定45
• 3.2.10 抗体灵敏度的检测45-46
• 3.2.11 抗体特异性的鉴定46
• 3.3 结果与讨论46-53
• 3.3.1 免疫血清效价测定46-47
• 3.3.2 杂交瘤细胞的观察和筛选47-48
• 3.3.3 阳性细胞孔的亚克隆48
• 3.3.4 腹水纯化结果48-49
• 3.3.5 抗体含量的确定49
• 3.3.6 抗体亚型的确定49-50
• 3.3.7 纯化后腹水效价的确定50-51
• 3.3.8 BPA竞争性抑制曲线的绘制51-52
• 3.3.9 抗体特异性鉴定52-53
• 3.4 讨论与小结53-55
• 3.4.1 本章小结53
• 3.4.2 讨论53-55
• 第四章 胶体金层析试纸条的建立55-71
• 4.1 试剂与仪器55-56
• 4.1.1 试剂55-56
• 4.1.2 材料与仪器56
• 4.2 实验方法56-60
• 4.2.1 胶体金的制备56
• 4.2.2 双酚A抗体探针的制备56-58
• 4.2.3 双酚A免疫层析试纸条的组装58-59
• 4.2.4 试纸条性能的测定59-60
• 4.3 结果与分析60-68
• 4.3.1 胶体金质量的鉴定60-62
• 4.3.2 胶体金标记抗体62-65
• 4.3.3 胶体金试纸组装65-66
• 4.3.4 试纸条性能的测试66-68
• 4.4 讨论与小结68-71
• 4.4.1 本章小结68-69
• 4.4.2 讨论69-71
• 参考文献71-76
• 攻读硕士学位期间发表的论文76-78
• 致谢78

【参考文献】

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