β-木糖苷酶的酶学性质鉴定及与木聚糖酶协同作用研究

发布时间：2017-07-20 14:07

  本文关键词：β-木糖苷酶的酶学性质鉴定及与木聚糖酶协同作用研究

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【摘要】：随着世界化石能源的日益消耗,可再生能源的开发利用越来越受到人们的关注,其中生物质能源因其来源丰富、用途广泛,在生物科技的不断发展进步的背景下,使用价值也在不断增加。木质纤维素是世界上最为丰富的生物质资源,不仅可以转化为能源,也可以转化成各种化学品,生物技术在许多的转化中扮演关键作用。半纤维素是木质纤维素中的一类,含量占木质纤维素的20%-30%。而木聚糖作为一种半纤维素,是植物中第二丰富的生物聚合物,仅次于纤维素。木聚糖最终降解成的木糖有着多种用途,例如微生物发酵生产乙醇。木聚糖生物降解过程需要木聚糖酶和β-木糖苷酶的参与,前者将木聚糖降解成小片段,后者则利用外切的性质将小片段水解释放木糖。因此,β-木糖苷酶的参与在木聚糖到木糖的生物转化中扮演着关键的作用。本课题着重研究了一种β-木糖苷酶ThXylC的酶学性质并探索了其与本课题组自有的一种木聚糖酶Xyn A协同降解木聚糖的效果。ThxylC基因来源于嗜热厌氧杆菌Thermoanerobacterium aotearoense SCUT27,该菌是从中国境内的一处温泉中分离得到的。通过氨基酸序列比对可知,该酶属于GH120家族。ThXylC经由分子操作带上六个组氨酸的标签,在E.coli BL21(DE3)中表达出来并通过镍柱亲和层析获得纯化蛋白。在酶学性质分析中,酶活为67.00 U/mg,最适反应温度和pH分别为6.5和65 oC。ThXylC有着较好的温度稳定性,在65 oC保温48 h之后,仍保留不低于50%的酶活。ThXylC关于终产物木糖的抑制常数为128 mM,保证了该酶在实际应用中对于产物有着较好的耐受性。Cu~(2+)和Ni~(2+)的存在对于酶活的影响较为显著,1 mM的Cu~(2+)和1 mM Ni~(2+)的存在使得ThXylC的酶活分别降至原酶活的24.3±4.4%和70.1±2.8%。在薄层层析的分析中,结果显示了ThXylC对于寡聚木糖(X2-X5)的彻底降解以及ThXylC和XynA(一种木聚糖酶)对于降解木聚糖的积极作用。在与木聚糖酶协同降解甘蔗渣的实验中,与只加入XynA的情况对比显示了在加入XylC之后,还原糖的含量由0.233 mmol/g甘蔗渣提高到了0.366 mmol/g甘蔗渣,提升幅度为57.1%。综合研究表明了ThXylC有着较大的工业应用的潜力。
【关键词】：嗜热厌氧杆菌 β-木糖苷酶 酶学性质 木聚糖酶 协同作用
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O629.8
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 第一章 绪论11-19
• 1.1 木质纤维素11-13
• 1.1.1 背景11-12
• 1.1.2 半纤维素与木聚糖12-13
• 1.2 木聚糖水解与 β-木糖苷酶13-16
• 1.2.1 木聚糖水解体系13-14
• 1.2.2 β-木糖苷酶的来源与分类14
• 1.2.3 糖苷水解酶催化机制研究14-15
• 1.2.4 β-木糖苷酶的热稳定性15-16
• 1.3 嗜热微生物资源利用16
• 1.4 大肠杆菌异源表达概况16-17
• 1.5 论文研究内容17-19
• 第二章 β-木糖苷酶基因在大肠杆菌中的克隆19-29
• 2.1 引言19
• 2.2 材料与方法19-26
• 2.2.1 菌株与载体19
• 2.2.2 主要仪器与试剂19-20
• 2.2.3 培养基的配制20-21
• 2.2.4 实验方法21-26
• 2.3 结果与方法26-28
• 2.3.1 β-木糖苷酶基因的克隆与表达载体的构建26-27
• 2.3.2 β-木糖苷酶基因ThxylC氨基酸序列分析27-28
• 2.4 本章小结28-29
• 第三章 β-木糖苷酶ThXylC的表达与纯化29-38
• 3.1 引言29
• 3.2 材料与方法29-35
• 3.2.1 菌株29
• 3.2.2 主要仪器与试剂29-30
• 3.2.3 主要试剂溶液的配制30-31
• 3.2.4 实验方法31-35
• 3.3 结果与讨论35-37
• 3.3.1 ThXylC的诱导表达（小量表达验证）35-36
• 3.3.2 ThXylC的纯化与脱盐36-37
• 3.4 本章小结37-38
• 第四章 β-木糖苷酶酶学性质研究38-48
• 4.1 引言38
• 4.2 材料与方法38-41
• 4.2.1 主要仪器与试剂38-39
• 4.2.2 实验方法39-41
• 4.3 结果与讨论41-46
• 4.3.1 ThXylC最适反应pH与温度的研究41
• 4.3.2 ThXylC热稳定性的研究41-42
• 4.3.3 ThXylC动力学参数的测定42-43
• 4.3.4 ThXylC底物特异性的测定43
• 4.3.5 金属离子、EDTA和糖对ThXylC的抑制研究43-46
• 4.4 本章小结46-48
• 第五章 重组 β-木糖苷酶ThXylC的协同水解作用48-57
• 5.1 引言48
• 5.2 材料与方法48-51
• 5.2.1 主要仪器与试剂48-49
• 5.2.2 实验方法49-51
• 5.3 结果与讨论51-56
• 5.3.1 重组木聚糖酶XynA的表达与纯化51-52
• 5.3.2 重组 β-木糖苷酶ThXylC的水解模式的鉴定52-54
• 5.3.3 还原糖标准曲线的建立54
• 5.3.4 ThXylC与木聚糖酶和纤维素酶协同水解甘蔗渣54-56
• 5.4 本章小结56-57
• 结论57-59
• 参考文献59-63
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果63-64
• 致谢64-65
• 附件65

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