鸟嘌呤化学发光反应研究及其分析应用

发布时间：2017-07-28 18:32

  本文关键词：鸟嘌呤化学发光反应研究及其分析应用

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【摘要】：鸟嘌呤(G)与3,4,5-三甲氧基苯甲酰甲醛(TMPG)可特异性反应产生瞬时化学发光。该化学发光体系简单、快速、且易与核酸识别相结合,在基于DNA识别的生物传感中具有很好的优势。本研究以此化学发光体系为研究对象,建立了测定酶活性和离子的新方法。具体研究内容如下：一.鸟嘌呤化学发光反应研究本工作中,我们对鸟嘌呤化学发光反应进行较系统地研究,探索了影响此化学发光强度的主要因素,详细考察了含有G碱基的DNA的序列及其构象对化学发光强度的影响,优化了反应条件,并探讨了鸟嘌呤化学发光与荧光分子间的共振能量转移。此研究为鸟嘌呤化学发光在生物传感中的应用奠定了基础。二.鸟嘌呤化学发光共振能量转移体系检测核酸外切酶Ⅰ的活性本工作中,设计了一个5'端标有生物素、3'端标有荧光素(FAM)的DNA探针PI(5'-biotin-AAA AAA AAA AGA GAG AGA GAG AGA GAG AG-FAM-3')。在没有Exo I存在下,生物素与链霉亲和素之间强烈的相互作用将DNA探针连接到用链霉亲和素标记的磁珠上,加入TMPG后体系发生化学发光共振能量转移产生强的化学发光信号；核酸外切酶I(Exo I)存在下,Exo I从3’端开始将探针P1切割成单核苷酸。此切割作用使最终连接到磁珠上富G的DNA序列变短,产生的化学发光强度减小,同时把3'末端标有FAM的G碱基单核苷酸切下后,TMPG-鸟嘌呤-FAM之间的化学发光共振能量转移不能发生,使得体系产生的化学发光强度大大降低。根据体系中化学发光强度变化,实现对Exo I活性的检测,检出限为1.1×10-5U/μL该方法将鸟嘌呤化学发光体系引入酶活性检测。结合磁珠的分离作用,该方法可望用于复杂样品中Exo I活性的检测。三.鸟嘌呤化学发光体系测定钾离子本工作中,我们首先筛选出对钾离子响应最佳的富G的DNA探针AG4(5'-TGG GTA GGG CGG GTT GGG AAA-3')。实验发现：在没有钾离子的存在下,探针AG4处于自由缠绕状态可以与TMPG在四丁基氢氧化铵-磷酸缓冲(pH8.5)中产生强的化学发光；在钾离子存在下,钾离子诱导探针AG4折叠成G-四聚体,加入TMPG后体系产生弱的化学发光。根据化学发光强度的降低,实现对钾离子的检测,检出限为9μM。该方法最有良好的选择性,钠离子、镁离子、钙离子等不产生干扰,已初步用于对尿液中钾离子含量的分析。此外,我们探讨了形成G-四聚体结构后化学发光强度降低的原因。由于G-四聚体之间G碱基之间形成的氢键作用,占据了TMPG与G碱基的反应位点,且G-四聚体的类平面结构使得TMPG与G碱基的化学发光反应受到阻碍,从而使体系的化学发光强度降低。四.鸟嘌呤化学共振能量转移法检测尿嘧啶-DNA糖基化酶活性实验发现：富G单链DNA和G-四聚体化学发光强度不同,而富G单链DNA和富G双链DNA发光强度基本相同。利用此现象,建立了TMPG-鸟嘌呤-FAM的CRET法检测尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)活性的方法。我们设计了一个双链DNA探针,其中一条探针为标记FAM且含有U碱基的富G的DNA序列,另一条为其互补序列。在没有UDG酶存在下,标记FAM的双链DNA与TMPG发生化学发光共振能量转移产生强的化学发光信号。UDG酶存在下,UDG酶水解双链DNA的U碱基,使得双链DNA解离成单链。在钾离子的诱导下,富G的DNA序列折叠形成G-四聚体,与TMPG反应产生弱的化学发光信号。利用双链DNA与G-四聚体化学发光强度之间的差异检测UDG酶的活性。该方法检测简单快速,检出限为0.3 U/mL。该方法用于检测UDG酶的抑制剂UGI抑制能力的考察,并用于定性分析Hela细胞中UDG酶的活性。
【关键词】：化学发光 鸟嘌呤 3 4 5-三甲氧基苯甲酰甲醛 核酸外切酶Ⅰ 尿嘧啶-DNA糖基化酶 钾离子
【学位授予单位】：陕西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O657.3
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 第1章 综述9-19
• 1.1 化学发光9-12
• 1.1.1 化学发光的简介9-10
• 1.1.2 化学发光体系分类10-12
• 1.2 鸟嘌呤瞬化学发光研究进展12-17
• 1.3 本论文的选题目的及意义17-19
• 第2章 研究内容19-59
• 2.1 鸟嘌呤化学发光体系研究19-27
• 2.1.1 引言19
• 2.1.2 实验部分19-21
• 2.1.3 结果与讨论21-25
• 2.1.4 小结25-27
• 2.2 鸟嘌呤化学发光共振能量转移体系检测核酸外切酶Ⅰ(Exo Ⅰ)的活性27-37
• 2.2.1 引言27-28
• 2.2.2 实验部分28-29
• 2.2.3 结果与讨论29-36
• 2.2.4 小结36-37
• 2.3 鸟嘌呤化学发光体系测定钾离子37-49
• 2.3.1 引言37-38
• 2.3.2 实验部分38-39
• 2.3.3 结果与讨论39-47
• 2.3.4 小结47-49
• 2.4 鸟嘌呤化学共振能量转移法检测尿嘧啶-DNA糖基化酶活性49-59
• 2.4.1 引言49-50
• 2.4.2 实验部分50-51
• 2.4.3 结果与讨论51-58
• 2.4.4 小结58-59
• 结论59-61
• 参考文献61-67
• 致谢67-69
• 攻读学位期间研究成果69

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本文编号：585459