木瓜蛋白酶过氧化物模拟酶性质及其分析应用

发布时间：2017-08-11 19:25

  本文关键词：木瓜蛋白酶过氧化物模拟酶性质及其分析应用

  更多相关文章： 木瓜蛋白酶 过氧化物模拟酶 比色分析法

【摘要】：自然界中的一切生命活动都有酶的参与,天然酶能在比较温和的条件下高效、专一地催化生化反应。由于其催化效率高、专一性强和条件温和等特点,使得酶催化在医药、农业和食品等领域得到广泛的应用。但是,天然酶又存在易失活、价格昂贵等缺点,限制了其应用。为了克服天然酶的缺点,人们相继开发了卟啉类模拟酶、主客体模拟酶、印迹高分子模拟酶、膜体系及配合物模拟酶等。由于具有表/界面效应、量子尺寸效应、小尺寸效应以及宏观量子轨道效应等效应,纳米材料具有优良的性能,得到广泛重视。然而,纳米材料的催化模拟酶活性却一直被人们忽视。自从2007年阎锡蕴小组发现四氧化三铁纳米粒子具有过氧化物模拟酶特性以后,纳米模拟酶迅速成为研究热点,研究者发现金属氧化物纳米材料、碳基纳米材料、贵金属纳米材料等多种纳米材料都具有过氧化物模拟酶活性。与天然酶相比,纳米材料模拟酶具有催化活性高、稳定性好、能耐受极端环境、重复利用率高等优点。但其中部分纳米材料的酶活性与其性质、组成、尺寸和表面修饰剂等有很大关系。很多纳米材料易于团聚,表面需要修饰稳定剂,而稳定剂的引入又往往会降低模拟酶活性;很多纳米材料还很难大批量,不同批次制备的同种纳米材料模拟酶活性往往也有差别。因此,寻找新的过氧化物模拟酶仍有重要意义。我们发现木瓜蛋白酶具有过氧化物模拟酶性质,详细研究了其催化机理和催化动力学;基于木瓜蛋白酶的过氧化物模拟酶活性,结合显色反应,构建了检测葡萄糖和谷胱甘肽的新方法。(1)本章发现木瓜蛋白酶具有过氧化物模拟酶催化活性,在H2O2存在下可以催化氧化底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)、邻苯二胺(OPD)、2,2’-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS),其催化活性与pH、温度、过氧化氢浓度和孵育时间有关,优化条件为pH 5.5,35℃,1 mM和2 h。稳态动力学结果表明其催化行为符合典型的Michaelis-Menten动力学模型,其催化机理遵循乒乓机理。同时我们对于未知成分做了分析,电感耦合等离子体质谱结果表明其过氧化物模拟酶催化活性并不源于其内含的金属杂质。与HRP孵育不同时间后测定其过氧化物模拟酶活性表明,过氧化物酶活性可能是来自一个未知的杂质。木瓜蛋白酶不仅有蛋白酶的功能,还具有类似过氧化物酶的功能。这为进一步认识酶的功能提供了新依据。(2)检测过氧化氢(H2O2)在生物、医学、环境保护和食品工业等许多领域都有着非常重要的意义。作为过氧化物模拟酶,木瓜蛋白酶可以催化TMB和H2O2的显色反应,且最终产物的颜色、最大吸收波长处(652 nm)的吸光度与H2O2的浓度呈相关性,因此可以直接检测过氧化氢的浓度。而葡萄糖在葡萄糖氧化酶(GOx)催化下可定量产生过氧化氢和葡萄糖酸,结合TMB-H2O2显色反应,我们还建立了一种简单、方便、灵敏和高选择性比色法检测葡萄糖的方法。(3)谷胱甘肽(GSH)广泛存在于自然界,其巯基基团对细胞中还原性环境的维持具有重要作用。作为过氧化物模拟酶,木瓜蛋白酶能够催化H2O2氧化TMB,产生的蓝色物质在652 nm处有吸收峰。这一显色反应中需要有阳离子自由基的参与,而还原性的GSH可以与阳离子自由基反应重新生成TMB,导致TMB氧化产物减少,蓝色褪去,652 nm处的吸光度值降低。基于此,我们设计一种新的比色传感器用于谷胱甘肽检测,线性范围为0.1-10μM,检测限为0.03μM。
【关键词】：木瓜蛋白酶 过氧化物模拟酶 比色分析法
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O657.3;O629.8
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 符号说明10-11
• 第一章 绪论11-25
• 1.1 纳米材料模拟酶11-20
• 1.1.1 金属氧化物纳米材料11-15
• 1.1.2 碳基纳米材料15-17
• 1.1.3 贵金属纳米材料17-19
• 1.1.4 其他纳米材料19-20
• 1.2 影响纳米材料的因素20-23
• 1.2.1 粒径20
• 1.2.2 形貌20-21
• 1.2.3 表面修饰和包覆21-22
• 1.2.4 构成22
• 1.2.5 催化剂和抑制剂22-23
• 1.3 木瓜蛋白酶23
• 1.4 结论和展望23-25
• 第二章 木瓜蛋白酶过氧化物模拟酶性质研究25-35
• 2.1 引言25-26
• 2.2 实验部分26-27
• 2.2.1 试剂与仪器26
• 2.2.2 顺磁共振（EPR）实验26
• 2.2.3 初速度的计算26-27
• 2.2.4 动力学实验方法27
• 2.3 结果与讨论27-34
• 2.3.1 木瓜蛋白酶的过氧化物模拟酶性质27-29
• 2.3.2 影响木瓜蛋白酶催化活性的因素29
• 2.3.3 木瓜蛋白酶稳定性29-30
• 2.3.4 木瓜蛋白酶的催化动力学及催化机理30-32
• 2.3.5 催化机理32
• 2.3.6 催化活性来源32-34
• 2.4 本章小结34-35
• 第三章 基于木瓜蛋白酶过氧化物酶活性的葡萄糖检测35-41
• 3.1 引言35-36
• 3.2 实验部分36-37
• 3.2.1 试剂与仪器36-37
• 3.2.2 H_2O_2的检测37
• 3.2.3 葡萄糖的测定37
• 3.2.4 血糖中葡萄糖的测定37
• 3.3 结果与讨论37-40
• 3.3.1 木瓜蛋白酶的过氧化物模拟酶活性37-38
• 3.3.2 测定条件优化38
• 3.3.3 过氧化氢和葡萄糖的检测38-40
• 3.4 结论40-41
• 第四章 基于木瓜蛋白酶过氧化物模拟酶活性检测谷胱甘肽41-47
• 4.1 引言41-42
• 4.2 实验部分42-43
• 4.2.1 试剂与仪器42
• 4.2.2 GSH的检测42-43
• 4.3 结果与讨论43-46
• 4.3.1 GSH的自由基恢复能力43
• 4.3.2 测定GSH条件的优化43-44
• 4.3.3 GSH检测44-45
• 4.3.4 选择性45-46
• 4.3.5 实际样的应用46
• 4.4 结论46-47
• 第五章 全文总结与展望47-48
• 参考文献48-62
• 硕士期间已发表和待发表的研究成果62-63
• 致谢63

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 ;我国木瓜蛋白酶生物提纯与应用技术研究取得突破[J];热带农业工程;2005年01期

2 熊华;;木瓜蛋白酶的应用研究进展[J];四川食品与发酵;2005年04期

3 王晓玲;王洪新;;茶多酚对木瓜蛋白酶的回收及其特性的影响[J];河南工业大学学报(自然科学版);2007年04期

4 牟利辉;;木瓜蛋白酶的应用研究[J];广东化工;2008年10期

5 方焕,生吉萍,吴显荣;工业生产中木瓜蛋白酶的活性检测方法比较[J];食品与机械;2000年06期

6 乙引,陈平,王茜,王明勇,柯波;木瓜蛋白酶改良啤酒品质的研究[J];酿酒科技;2001年02期

7 ;我国木瓜蛋白酶生物提纯与应用技术研究取得突破[J];山东食品发酵;2005年02期

8 何继芹;张海德;;木瓜蛋白酶的分离方法及其应用进展[J];食品科技;2006年10期

9 惠丽娟;;木瓜蛋白酶的研究进展[J];中国西部科技;2007年18期

10 李卫民;;木瓜蛋白酶活力的快速测定[J];饮料工业;2009年10期

中国重要会议论文全文数据库 前4条

1 何佳;邵学广;蔡文生;;木瓜蛋白酶在二氧化硅表面的吸附[A];中国化学会第29届学术年会摘要集——第19分会：化学信息学与化学计量学[C];2014年

2 边文越;刘双喜;;SBA-15固载木瓜蛋白酶的研究[A];中国化学会第26届学术年会纳米化学分会场论文集[C];2008年

3 卢雁;张玮玮;王公轲;;Ag，Cr与木瓜蛋白酶作用的研究[A];第五届全国化学生物学学术会议论文摘要集[C];2007年

4 施建平;，

本文编号：657887