基于酶催化信号扩增电化学检测DNA甲基化及其应用研究

发布时间：2017-08-14 01:34

  本文关键词：基于酶催化信号扩增电化学检测DNA甲基化及其应用研究

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【摘要】：DNA甲基化是基因组中的一种重要的表观遗传修饰,在原核生物和真核生物生长发育中扮演重要的角色。异常的DNA甲基化与各种疾病有关,例如癌症。众所周知,DNA甲基化是在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMT)的作用下,以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体,将甲基转移到5'-CG-3'序列(CpG)的胞嘧啶5位碳上,生成5-甲基胞嘧啶,或者将甲基转移到腺嘌呤的6位碳上。因此DNA甲基化水平与甲基转移酶活性息息相关,检测DNA甲基转移酶活性和抑制因子筛选有重要意义。目前,DNA甲基转移酶的检测方法主要有放射性标记、重硫酸盐处理、比色和高效液相法等。但这些方法存在一些缺点,如放射性标记法对生物组织有伤害,重硫酸盐处理将胞嘧啶转化为尿嘧啶耗时长,比色法虽然简单,但金纳米粒子容易聚沉,高效液相色谱法需要大型仪器成本高。因此,发展简单、快速DNA甲基化和甲基转移酶活性的分析方法非常必要。5-hmC被认为是基因中的第六种碱基,主要分布于神经元细胞,小鼠脑细胞和胚胎干细胞中。同时,在许多种癌细胞中它的含量相对于正常细胞降低。因此,5-hmC的表达水平可以作为检测癌症的标志物。目前检测5-hmC的方法有薄层色谱法、高效液相法、酶催化放射性标记法等,但是这些方法都有许多缺点。例如,高效液相法需要大型仪器,酶催化放射性标记法伤害生物组织。因此,依然需要发展一种简单、快速检测基因组DNA中5-hmC的方法。本文利用CdS量子点、Bi2S3光电纳米材料、生物酶和抗体等,并通过酶催化放大技术,制备了两种光电化学生物传感器和两种电化学生物传感器,对甲基转移酶活性进行了分析并且对细胞中5-hmC的含量进行了检测。(1)本文利用Bi2S3光电纳米材料和酶催化信号放大技术制备了一种用于M.Sss I甲基转移酶活性分析和其抑制因子筛选的光电生物传感器。5-m C抗体作为识别单元,SA-AuNPs作为信号扩增单元,ALP作为酶催化单元。在甲基转移酶存在的情况下,发卡DNA可以被甲基化。当与生物素修饰的DNA杂交后形成双链DNA(ds-DNA),ds-DNA可以被俘获到抗体修饰的电极表面,随后SA-AuNPs和ALP-biotin可以通过生物素与链霉亲和素的特异性识别依次被俘获到电极表面。碱性磷酸酯酶(ALP)原位催化水解L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐产生抗坏血酸分子作为电子供体,从而增强光电信号。制备的传感器表现出了很好的灵敏性,对甲基转移酶检测限为0.33 unit/mL。而且,对抑制剂的筛选证明RG108对甲基转移酶活性有抑制作用,半数抑制量为152.54 nM。(2)基于G-四连体和ExoIII的电化学传感器检测甲基转移酶活性。首先,探针双链DNA固定到金电极表面,随后将DNA甲基转移酶滴加到电极表面,甲基化后用DpnI切割。这样甲基化的DNA链可以被ExoIII消解释放富含G的DNA单链。在氯化血红素和钾离子存在的情况下,其可以形成氯化血红素/G-四连体结构。氯化血红素/G-四连体可以在双氧水存在的情况下催化对苯二酚生成苯醌。苯醌可以产生较大的电信号。最后我们用还原石墨烯修饰的金电极作为工作电极进行电化学测量。制备的电化学传感器展现了较好的灵敏度。对DAM甲基转移酶的检测限为0.31 unit·m L-1。抑制剂的研究表明,表儿茶素能够抑制DAM甲基转移酶活性,半数抑制量为157μM。(3)基于5-hmC抗体,生物素功能化的phos-tag(Phos-tag-biotin)和亲和素修饰的碱性磷酸酯酶(avidin-ALP)的电化学免疫传感器定量检测乳腺癌细胞中的5-hmC。5-hmC抗体作为识别单元,Phos-tag-biotin作为连接单元,avidin-ALP作为酶催化信号扩增单元。首先5-羟甲基胞嘧啶脱氧核苷酸被俘获到抗体修饰的电极表面,之后Phos-tag-biotin通过与磷酸根的作用俘获到电极表面。最后,avidin-ALP通过亲和素和生物素的特异性结合作用固定到电极表面。通过ALP催化对硝基苯磷酸二钠产生电活性分子对硝基苯酚。实验结果表明,制备的电化学免疫传感器展现出了很好的灵敏度,检测限为0.032nM。而且通过制备的电化学免疫传感器成功的对乳腺癌细胞中的5-hmC含量进行了分析,发现与正常乳腺细胞比较,5-hmC在乳腺癌细胞中的含量大量降低。(4)基于原位产生电子供体和全波长光作为激发光的策略制备光电传感器检测5-hmC。首先,通过酰胺键将氨基修饰的探针DNA固定到羧基修饰的磁性微球表面。在M.HhaI和半胱胺存在的条件下,含有5-hmC的探针DNA可以被氨基化。随后NHS-biotin能够被标记到氨基化的DNA链上。随后通过亲和素和生物素的特异性结合作用将亲和素修饰的ALP可以被俘获到磁性微球表面。ALP原位催化水解L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐产生抗坏血酸作为电子供体。磁分离后,在全波长的光照射下以CdS修饰的ITO作为工作电极进行光电检测。制备的传感器展现出了很好的灵敏度,检测限为0.167 nM。
【关键词】：DNA甲基化 生物传感器 表观遗传学
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q75;O657.1
【目录】：

• 符号说明4-9
• 中文摘要9-11
• Abstract11-14
• 1 前言14-23
• 1.1 表观遗传学14
• 1.1.1 表观遗传学概述14
• 1.1.2 表观遗传学研究内容14
• 1.2 DNA甲基化概述14-15
• 1.2.1 DNA甲基转移酶活性抑制剂14-15
• 1.3 DNA甲基化检测技术15-17
• 1.3.1 亚硫酸盐方法检测DNA甲基化15-16
• 1.3.2 高效液相色谱法16
• 1.3.3 敏感甲基化单个核苷酸引物延伸法16-17
• 1.3.4 电化学方法17
• 1.4 DNA羟甲基化概述17-18
• 1.5 DNA羟甲基检测技术18-19
• 1.6 电化学生物传感器19-20
• 1.6.1 酶信号扩增电化学生物传感器19
• 1.6.3 电化学免疫传感器19
• 1.6.4 电化学DNA传感器19-20
• 1.7 光电化学生物传感器20-21
• 1.8 本课题的提出及主要研究内容21-23
• 2 材料与方法23-35
• 2.1 仪器与试剂23-26
• 2.1.1 仪器23-24
• 2.1.2 试剂24-25
• 2.1.3 实验中主要缓冲溶液的配置25-26
• 2.2 试验方法26-35
• 2.2.1 基于信号扩增策略的光电化学生物传感器检测甲基转移酶活性26-29
• 2.2.1.1 Au纳米粒子的制备26
• 2.2.1.2 链霉亲和素标记纳米金26-27
• 2.2.1.3 硫化铋的制备27
• 2.2.1.4 ITO电极预处理27
• 2.2.1.5 生物传感器的制备27-28
• 2.2.1.6 光电化学信号检测28-29
• 2.2.1.7 生物传感器的选择性和抑制因子的筛选29
• 2.2.1.8 光电材料稳定性检测29
• 2.2.2 基于G-四连体和外切酶III的电化学方法检测Dam甲基转移酶活性29-31
• 2.2.2.1 电极预处理29-30
• 2.2.2.2 工作电极的制备30
• 2.2.2.3 探针DNA的固定30
• 2.2.2.4 DNA甲基化及酶切处理30
• 2.2.2.5 G-四连体的形成30
• 2.2.2.6 电化学信号检测30-31
• 2.2.2.7 生物传感器选择性检测和抑制因子的筛选。31
• 2.2.3 基于全光照射的光电生物传感器检测DNA羟甲基化。31-33
• 2.2.3.1 CdS量子点的制备和工作电极31
• 2.2.3.2 磁性微球对双链DNA的固定31-32
• 2.2.3.3 氨基-衍生化 5-hmC32
• 2.2.3.4 NHS-生物素和亲和素标记的碱性磷脂酶的固定32
• 2.2.3.5 光电信号测量32-33
• 2.2.3.8 特异性检测33
• 2.2.4 基于电化学免疫传感器定量分析乳腺癌细胞中的 5-hmC33-35
• 2.2.4.1 玻碳电极预处理33
• 2.2.4.2 石墨烯-傒四羧酸（GR-PTCA）的制备33-34
• 2.2.4.3 生物传感器的制备34
• 2.2.4.4 工作电极的制备34
• 2.2.4.5 电化学检测34-35
• 2.2.4.6 实际样品的检测35
• 3 结果与分析35-48
• 3.1 基于信号增加的光电化学生物传感器检测甲基转移酶活性35-38
• 3.1.1 EIS分析和可行性分析35-36
• 3.1.2 优化甲基化时间36-37
• 3.1.3 甲基转移酶活性的检测37-38
• 3.1.4 抑制因子的筛选38
• 3.2 基于G-四连体和外切酶III的电化学方法检测Dam甲基转移酶活性38-41
• 3.2.1 实验可行性分析38-39
• 3.2.2 Dam甲基转移酶活性分析39-40
• 3.2.3 精确性，重现性和特异性分析40
• 3.2.4 抑制因子的筛选40-41
• 3.3 基于全光射的的光电生物传感器检测DNA羟甲基化41-44
• 3.3.1 实验可行性分析41-42
• 3.3.2 条件优化42
• 3.3.3 标准曲线的绘制，传感器选择性和重现性的分析42-44
• 3.4 基于电化学免疫传感器定量分析乳腺癌细胞中的 5-hmC44-48
• 3.4.1 EIS和可行性分析44-45
• 3.4.2 条件优化45
• 3.4.4 标准曲线的绘制，，特异性和重现性分析45-46
• 3.4.5 实际样品检测46-48
• 4 讨论48-51
• 4.1 基于信号增加策略的光电化学生物传感器检测甲基转移酶活性48
• 4.2 基于G-四连体和外切酶III的电化学方法检测Dam甲基转移酶活性48-49
• 4.3 基于全光射的光电生物传感器检测DNA羟甲基化49-50
• 4.4 基于电化学免疫传感器定量分析乳腺癌细胞中的 5-hmC50-51
• 5. 结论51-52
• 5.1 基于信号增加策略的光电化学生物传感器检测甲基转移酶活性51
• 5.2 基于G-四连体和外切酶III的电化学方法检测Dam甲基转移酶活性51
• 5.3 基于全光射的光电生物传感器检测DNA羟甲基化51
• 5.4 基于电化学免疫传感器定量分析乳腺癌细胞中的 5-hmC51-52
• 6 创新之处52-53
• 7 参考文献53-62
• 8 致谢62-64
• 9 攻读学位期间发表论文情况64

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 王光丽;徐静娟;陈洪渊;;光电化学传感器的研究进展[J];中国科学(B辑:化学);2009年11期

2 蔡新霞,李华清,饶能高,王利,崔大付;电化学生物传感器[J];微纳电子技术;2003年Z1期

3 邓大君,邓国仁,吕有勇,周静,辛慧君;变性高效液相色谱法检测CpG岛胞嘧啶甲基化[J];中华医学杂志;2001年03期

4 岳林海,徐铸德;半导体的表面修饰与其光电化学应用[J];化学通报;1998年09期

本文编号：670112