聚电解质多层膜实现动态界面硬度用于原位调控细胞行为的研究

发布时间：2017-08-22 10:11

  本文关键词：聚电解质多层膜实现动态界面硬度用于原位调控细胞行为的研究

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【摘要】：研究表明,除了表面化学组成和拓扑结构以外,材料的物理机械性能---硬度,对细胞的黏附、增殖、分化、迁移等一系列行为也会产生重大影响。在生物体内,细胞所处的微环境是动态变化的,其中硬度也会随之发生改变。目前基于硬度对细胞行为的材料设计研究集中在水凝胶材料中,且硬度变化以静态为主。随着层层组装多层膜技术的发展,制备硬度可控的微纳尺寸的层状组装多层膜技术也受到越来越多研究者的重视。本课题研究以层状组装多层膜技术为基础,利用二硫键的可逆性,构建了具有动态界面硬度的多层膜方法,进一步探索了该动态硬度界面对细胞行为的影响规律。首先我们制备了巯基修饰的透明质酸(HA-SH),通过层层组装技术构建聚赖氨酸/透明质酸(PLL/HA-SH)n多层膜。石英晶体微天平(QCM)结果证明HA-SH可以和PLL进行层层组装构建多层膜。共聚焦显微镜结果显示12双层多层膜厚度在3.4μm左右,分布均匀。紫外可见吸收光谱(UV-vis)结果显示,多层膜中的巯基在氯胺T(CaT)的氧化作用下,90%的巯基在1min内就被氧化成二硫键,从而使多层膜得到交联。原子力显微镜测定的杨氏模量结果显示,交联后的多层膜的硬度可以由60±7.6 kPa提高到210±10 kPa,在还原剂谷胱甘肽(GSH)的还原作用下,其硬度可以还原到未交联的程度。以成纤维细胞3T3为细胞模型的细胞实验证明,3T3细胞无法粘附在未交联的多层膜上,而在交联后的多层膜表面可以很好的黏附、增殖。原位对多层膜进行GSH处理,使多层膜解交联,10小时后,细胞的形貌会发生变化：由铺展状态变为回缩状态,同时细胞活性也降低将近30%。通过构建二硫键可逆交联的多层膜,我们实现了对材料表面硬度的原位调节,进一步实现了对细胞黏附行为的原位调控。在心血管植入材料表面的内皮化过程中,首先内皮细胞在材料表面需要快速黏附和增殖。其次,当内皮细胞完全覆盖材料表面后,新生的内皮层行使正常的内皮功能。研究表明,提高材料表面硬度有利于内皮细胞的黏附和增殖,而硬度的降低则能够促进内皮功能。因此,构建动态硬度界面材料,能够促进内皮细胞内皮化的过程。我们选用CaT交联的PLL/HA-SH多层膜表面作为硬度动态界面。首先在多层膜上培养内皮,形成完整的内皮层。随后在培养基中加入谷胱甘肽(GSH),原位实现PLL/HA-SH多层膜的解交联,降低材料硬度。并深入表征了内皮层的形貌、致密性、凝血酶刺激后的形貌变化,一氧化氮分泌量。数据显示,交联的(PLL/HA-SH)多层膜能够促进内皮细胞的黏附和增殖,形成内皮层。内皮层在GSH降解后的多层膜表面,有着更好的致密性,并显现出更高的一氧化氮分泌量。
【关键词】：层状组装多层膜 动态硬度 成纤维细胞 内皮细胞 内皮化
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q2-33;O631
【目录】：

• 致谢4-6
• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 第一章 绪论13-35
• 1.1 细胞外微环境对细胞行为的影响13-17
• 1.1.1 细胞外基质13-14
• 1.1.2 细胞外基质的物理因素---硬度14-16
• 1.1.3 界面硬度对成纤维细胞3T3和内皮细胞的影响16-17
• 1.2 层层组装多层膜的物理机械性能调控17-29
• 1.2.1 层层组装技术17-22
• 1.2.2 多层膜界面硬度的调控22-25
• 1.2.3 动态界面25-29
• 1.3 二硫键的结构及其性质29-33
• 1.3.1 二硫键在生物医用方面的应用29-31
• 1.3.2 二硫键在多层膜中的应用31-33
• 1.4 课题提出及研究思路33-35
• 第二章 基于二硫键构建动态硬度界面原位观察3T3细胞的变化35-52
• 2.1 引言35-36
• 2.2 实验部分36-42
• 2.2.1 化学试剂36-37
• 2.2.2 主要仪器及表征37
• 2.2.3 HA-SH合成37-38
• 2.2.4 核磁共振波谱仪(~1HNMR)38
• 2.2.5 Ellman检测巯基含量38-39
• 2.2.6 组装液配置和多层膜的构建39
• 2.2.7 多层膜的表征39
• 2.2.8 激光共聚焦显微镜(CLSM)39-40
• 2.2.9 多层膜上巯基的定量计算40
• 2.2.10 多层膜的交联40
• 2.2.11 杨氏模量的测定40
• 2.2.12 胞的培养40-41
• 2.2.13 细胞毒性研究41-42
• 2.3 结果与讨论42-51
• 2.3.1 HA-SH的合成42
• 2.3.2 Ellman's方法检测巯基的含量42-43
• 2.3.3 QCM-D跟踪多层膜的组装43-44
• 2.3.4 共聚焦显微镜观察(PLL/HA-SH)_(12)的纵向结构和湿态厚度44-45
• 2.3.5 多层膜的交联45-46
• 2.3.6 多层膜硬度的测定46-47
• 2.3.7 胞黏附实验47-49
• 2.3.8 细胞对动态硬度变化的响应49-51
• 2.4 本章小结51-52
• 第三章 柔性多层膜提升内皮细胞活性与维持内皮细胞功能52-62
• 3.1 引言52
• 3.2 实验部分52-55
• 3.2.1 多层膜的组装与交联53-54
• 3.2.2 多层膜杨氏模量的测定54
• 3.2.3 细胞的培养54
• 3.2.4 内皮细胞的增殖实验54
• 3.2.5 内皮细胞的表征54-55
• 3.2.6 内皮细胞致密性的表征55
• 3.2.7 一氧化氮(NO)的检测55
• 3.3 实验结果与讨论55-61
• 3.3.1 多层膜杨氏模量的测定55-56
• 3.3.2 内皮细胞的黏附和增殖56-57
• 3.3.3 GSH对内皮层的影响57-59
• 3.3.4 内皮层形貌和致密性的表征59-60
• 3.3.5 NO的检测60-61
• 3.4 本章小结61-62
• 第四章 全文主要结论、创新和展望62-64
• 全文结论62
• 特色与创新62-63
• 问题与展望63-64
• 参考文献64-74
• 作者简介74

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本文编号：718525