基于核酸适配体与氧化石墨烯的荧光传感器对奶制品中β-内酰胺酶的检测研究

发布时间：2017-09-03 15:05

  本文关键词：基于核酸适配体与氧化石墨烯的荧光传感器对奶制品中β-内酰胺酶的检测研究

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【摘要】：β-内酰胺酶(β-lactamase)是一种能水解青霉素及头孢类抗生素的灭活酶,所以被不法分子作为拮抗剂,非法添加到食品或食品原料(例如牛奶和生乳)中,从而达到掩蔽抗生素的目的,影响残留抗生素的检测,生产人造“无抗奶”。如果人们长期食入非法添加β-内酰胺酶的奶制品,一方面会增加人体内细菌的耐药性,严重时会产生“超级细菌”,此外还会出现荨麻疹、发热、甚至过敏性休克等危害；另一方面在β-内酰胺酶分解抗生素后,可能会引进其它有害的物质,如：青霉噻唑酸。因此,建立一种高效、可靠、灵敏的荧光传感器分析方法(Fluorescent sensor assay, FSA)来实现快速检测奶制品中的p-内酰胺酶的残留,这对于打击食品领域的违法犯罪行为,保障食品安全和人们健康具有重要实际意义。本论文首先采用天然鳞片石墨粉,通过Hummers法来制备氧化石墨烯(Graphene oxide, GO),利用紫外光谱、红外光谱、X射线衍射仪、拉曼光谱、热重分析对所制备的GO进行鉴定,并通过电镜来对其进行相貌分析。然后利用羧基荧光素(FAM)修饰的p-内酰胺酶核酸适配体(FDNA)替代传统抗体来与β-内酰胺酶作用,通过琼脂糖凝胶电泳和紫外光谱鉴定。本研究建立的荧光传感器方法的原理是：当体系中无β-内酰胺酶时,FDNA会与GO通过π-π共轭等方式吸附在GO表面,利用GO和FDNA之间的荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)从而快速猝灭FDNA的荧光信号这一性质,从而使体系处于低荧光信号阶段；另一方面,当系统中存在p-内酰胺酶时,FDNA会特异性地与β-内酰胺酶结合,阻碍了FDNA与GO之间的荧光能量转移,从而使体系处于高荧光信号。在对实验原理和FDNA验证及实验条件进行最优化处理后,建立一种基于FDNA和GO的FSA方法,用于检测奶制品中β-内酰胺酶含量,检测限为0.5 U/mL,检测范围为1-46 U/mL,相关系数R2=0.999。并结合酶联免疫吸附方法ELISA对FSA方法进行验证,两种方法同时对奶制品样品做添加回收试验,FSA法的回收率为96.04%-119.67%,每个样本的变异系数小于6.70%;ELISA法为93.10%-119.06%,每个样本的变异系数小于7.93%,FSA法与ELISA法的相关系数为0.993。由此可以得出,本实验建立的FSA方法可靠、灵敏、特异性高,适用于分析检测奶制品中p-内酰胺酶的残留量。
【关键词】：β-内酰胺酶 核酸适配体 氧化石墨烯 荧光传感器分析
【学位授予单位】：广东工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O657.3;TS207.3
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-15
• 第一章 绪论15-37
• 1.1 核酸适配体15-19
• 1.1.1 核酸适配体的特性15-17
• 1.1.2 核酸适配体的固定17-19
• 1.2 核酸适配体的应用19-24
• 1.2.1 生物医学方面19-20
• 1.2.2 食品有害物质检测方面20-21
• 1.2.3 生物传感器方面21-24
• 1.3 SELEX技术24-26
• 1.4 SELEX技术的发展26-28
• 1.4.1 毛细管电泳-SELEX26
• 1.4.2 靶标消除-SELEX26-27
• 1.4.3 复合靶-SELEX27
• 1.4.4 亲和层析-SELEX27
• 1.4.5 细胞靶-SELEX27-28
• 1.5 氧化石墨烯28-31
• 1.5.1 氧化石墨烯的制备28-30
• 1.5.2 氧化石墨烯的应用30-31
• 1.6 β-内酰胺酶分析检测方法研究进展31-34
• 1.6.1 杯碟法32
• 1.6.2 色法32-33
• 1.6.3 酸度计法33
• 1.6.4 碘量法33
• 1.6.5 高效液相、气相色谱法33
• 1.6.6 免疫学法33-34
• 1.7 课题研究目的及其意义34-35
• 1.8 研究思路及内容35-36
• 1.9 课题来源36-37
• 第二章 氧化石墨烯的合成与鉴定37-51
• 2.1 前言37-38
• 2.2 实验部分38-39
• 2.2.1 材料与试剂38-39
• 2.2.2 实验仪器39
• 2.3 实验方法39-42
• 2.3.1 氧化石墨烯的合成39-41
• 2.3.2 测试与表征41-42
• 2.4 结果与分析42-50
• 2.4.1 实验过程分析42-43
• 2.4.2 氧化石墨烯与石墨在水中分散性对比43-44
• 2.4.3 氧化石墨烯的紫外光谱扫描结果44-45
• 2.4.4 氧化石墨烯的红外光谱扫描结果45-46
• 2.4.5 氧化石墨烯的X射线衍射扫描结果46-47
• 2.4.6 氧化石墨烯的拉曼光谱扫描结果47-48
• 2.4.7 氧化石墨烯的热重分析结果48-49
• 2.4.8 氧化石墨烯的电镜形貌分析结果49-50
• 2.5 小结与讨论50-51
• 2.5.1 小结50
• 2.5.2 讨论50-51
• 第三章 β-内酰胺酶荧光传感器分析方法研究51-71
• 3.1 前言51-52
• 3.2 实验材料52-54
• 3.2.1 材料与试剂52-53
• 3.2.2 实验仪器53
• 3.2.3 溶液配制53-54
• 3.3 实验方法54-61
• 3.3.1 实验原理54-56
• 3.3.2 氧化石墨烯对FDNA荧光信号猝灭的检测56-57
• 3.3.3 β-内酰胺酶对氧化石墨烯荧光信号影响的测试57
• 3.3.4 FDNA与β-内酰胺酶结合的鉴定57-58
• 3.3.5 实验条件的优化58-60
• 3.3.6 特异性实验60
• 3.3.7 荧光传感器方法的建立60-61
• 3.4 结果与分析61-69
• 3.4.1 氧化石墨烯对FDNA荧光信号影响的测定61-62
• 3.4.2 β-内酰胺酶对氧化石墨烯荧光信号的影响62-63
• 3.4.3 FDNA与β-内酰胺酶结合鉴定结果63-64
• 3.4.4 反应体系的优化64-67
• 3.4.5 荧光传感器方法特异性的测定67-69
• 3.4.6 标准曲线的绘制69
• 3.5 小结与讨论69-71
• 3.5.1 小结69-70
• 3.5.2 讨论70-71
• 第四章 含β-内酰胺酶奶制品样品的荧光传感器及酶联免疫吸附法分析71-81
• 4.1 前言71-72
• 4.2 实验材料72
• 4.3 实验方法72-76
• 4.3.1 奶制品样品的前处理72-73
• 4.3.2 ELISA法实验步骤73-74
• 4.3.3 ELISA法检测奶制品样品74-75
• 4.3.4 荧光传感器方法和ELISA法添加回收率测定75
• 4.3.5 荧光传感器方法和ELISA方法比对75-76
• 4.4 结果与分析76-80
• 4.4.1 ELISA法分析奶制品样品76-77
• 4.4.2 奶制品样品的加样回收率77-79
• 4.4.3 荧光传感器方法和ELISA法的相关性分析79-80
• 4.5 小结与讨论80-81
• 4.5.1 小结80
• 4.5.2 讨论80-81
• 结论与展望81-83
• 参考文献83-92
• 攻读硕士期间发表的论文92-94
• 致谢94

【参考文献】

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本文编号：785690