超高静压对白芥子中芥子酶催化反应的影响机制研究

发布时间：2017-09-08 12:23

  本文关键词：超高静压对白芥子中芥子酶催化反应的影响机制研究

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【摘要】：芥子酶能够催化硫代葡萄糖苷类物质生成具有抗癌功效的异硫氰酸酯,具有重要的研究价值。本研究以白芥子中芥子酶为对象,对其酶学特性进行研究,并从酶活力、反应动力学以及酶构象等方面分析超高静压对芥子酶催化反应的影响,同时研究了压力及多羟基醇对酶热稳定性和反应进程的影响。弥补芥子酶在超高静压处理方面的研究空白,拓展芥子酶在食品加工中的应用。1.通过硫酸铵分级沉淀、透析、ConA亲和柱层析等方法从白芥子中提取、分离和纯化得到芥子酶。结果显示,0~20%硫酸铵饱和度部分提取所得酶液比活力最大,为7.8U/mg,所以用作后续酶学特性的研究。2.利用SDS-Page测定分子量、利用葡萄糖试剂盒法和高效液相色谱测定酶活,对芥子酶酶学特性进行研究。结果表明,白芥芥子酶的分子量约为75 kDa,最适pH为7,最适温度为55°C;NaCl溶液对芥子酶活力有抑制作用;Vc能有效地促进酶活,添加0.1mmol/L Vc时的酶活为对照组的4.8倍;酶浓度与酶活并非呈线性正相关关系;常压(0.1MPa)下的米氏常数Km=1.265 mmol/L,最大反应速度Vmax=0.150 mmol/min。3.研究了超高静压下不同因素对芥子酶催化反应的影响。这些因素包括:压力强度、pH、缓冲液、处理时间和酶稳定剂(多羟基醇)等。研究发现:(1)200~600 MPa压力强度均降低芥子酶活力,且600 MPa下酶水解底物的能力仅为对照组的0.53倍。(2)在超高静压下研究不同pH值、不同缓冲液类型对酶活的影响,发现芥子酶在pH为6时活力最高,但其活力受缓冲液类型影响较大,其中芥子酶在乙酸铵缓冲液中的稳定性较好。(3)研究不同保压时间对酶活力的影响,结果表明增大保压时间(从1 min延长至20 min)对酶活力的影响较小,ANOVA分析显示保压时间对酶活的影响无统计学差异。(4)研究酶稳定剂多羟基醇(甘油和山梨醇)对芥子酶热稳定性的影响,结果表明超高静压处理使得芥子酶的热稳定性降低,但多羟基醇在一定条件下可起到有效的保护作用;在添加0.1 mol/L的甘油的情况下,较高温度时(65°C),甘油对芥子酶起一定的保护作用,使得芥子酶的热稳定性提高;添加3 mol/L的山梨醇也同样能提高芥子酶的热稳定性。研究多羟基醇对芥子酶催化反应的影响,表明常压下甘油可促进芥子酶催化反应进程,但影响较小;而山梨醇在常压及高压下均能促进芥子酶催化反应进程,且高压下促进效果较常压更显著。(5)研究了不同压力下芥子酶的动力学参数,可知超高静压处理提高了芥子酶与底物的结合能力,Km值在100~600 MPa范围内随着压力的升高先减小后增大,但均低于常压下的值。随着压力的增大,最大反应速率Vmax表现出下降的趋势。研究得到了0.1~600MPa/常温(25°C)条件下芥子酶的反应活化体积,为△V!=4.46 cm3/mol,即提高压力会降低酶催化反应速度。4.研究了超高静压处理对纯化后的芥子酶酶活的影响,并通过圆二色光谱、荧光光谱测定了超高静压处理对酶构象的影响。结果表明,超高静压下纯化后的芥子酶活力得到提高,酶蛋白表面的二硫键含量也升高;超高静压使芥子酶纯品的二级结构发生了变化,随着压力的增大,"-螺旋含量降低,#-折叠含量升高;同时,超高静压影响了芥子酶纯品的三级结构,使更多疏水性的Trp暴露于极性环境中,荧光强度增强。
【关键词】：超高静压 芥子酶 催化反应 酶活 构象
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O629.8
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 第一章 绪论10-21
• 1.1 芥子酶及其研究进展10-15
• 1.2 超高静压及其研究进展15-19
• 1.3 研究内容和目的19-20
• 1.4 创新之处20-21
• 第二章 芥子酶的提取分离21-31
• 2.1 引言21
• 2.2 实验试剂及仪器21-22
• 2.3 实验方法22-26
• 2.4 结果与讨论26-30
• 2.5 本章小结30-31
• 第三章 芥子酶酶学特性的研究31-40
• 3.1 引言31
• 3.2 实验试剂及仪器31-32
• 3.3 实验方法32-35
• 3.4 结果与讨论35-39
• 3.5 本章小结39-40
• 第四章 超高静压对芥子酶催化反应的影响40-54
• 4.1 引言40
• 4.2 实验试剂及仪器40-41
• 4.3 实验方法41-43
• 4.4 结果与讨论43-53
• 4.5 本章小结53-54
• 第五章 超高静压对芥子酶构象的影响54-63
• 5.1 引言54
• 5.2 实验试剂及仪器54
• 5.3 实验方法54-57
• 5.4 结果与讨论57-61
• 5.5 本章小结61-63
• 第六章 结论与展望63-65
• 6.1 结论63-64
• 6.2 展望64-65
• 参考文献65-72
• 在校期间论文发表情况72-73
• 致谢73

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本文编号：814005