自组装DNA凝胶作为固定化酶载体的应用研究

发布时间：2017-09-12 13:26

  本文关键词：自组装DNA凝胶作为固定化酶载体的应用研究

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【摘要】：固定化酶技术是现代生物催化的核心技术。通过酶固定有望提高酶的催化效率,提高回收率,延长酶的保质期,为酶的生物医学应用以及工业应用奠定基础。固定化酶技术关键在于新型功能载体材料的研究与发展。DNA凝胶具有DNA的序列可编程性、便于合成与修饰,能够可控组装,并且具有较好的生物相容性,可降解性以及高的渗透性。这些优点赋予了DNA凝胶作为载体材料在蛋白质装载、药物装载与释放、胞外蛋白生产、DNA免疫治疗等领域潜在的应用前景。近年来DNA凝胶已经被广泛的用于固定和装载客体分子,比如酶、蛋白质和纳米颗粒以及微米级的细胞。本文利用DNA凝胶可控组装等优点,发展了DNA-蛋白质杂合凝胶,实现了生物酶的固定；并且构建了基于DNA凝胶的生物酶级联反应体系,具体内容如下：1.基于DNA超级三明治杂交反应和链霉亲和素生物连接作用,构建了DNA-蛋白质杂合凝胶,实现了酒精氧化酶(AOx)的生物固定,提高了AOx的生物稳定性。首先通过超级三明治杂交反应形成具有周期性生物素的杂交双链,加入链霉亲和素以及客体生物分子AOx,基于同步组装方法,构建了DNA-蛋白质凝胶,实现了AOx的有效包被。酶的装载效率是42%,负载容量是18 mg AOx/g凝胶。形成的杂合凝胶直径6.7±2.1 μm,类似于花朵状,具有多孔的三维凝胶结构。装载在DNA-蛋白质凝胶中AOx与血清培育24 h后,保持78%生物催化活性。基于DNA-蛋白质凝胶表面的生物素位点和本身带负电的特性,可以直接固定于链霉亲和素修饰的96孔板以及氨基正电化的玻片上,实现了基于凝胶的AOx酶表面固定。在55℃加热,与有机试剂DMSO培育,5次反复冻融的实验条件下,装载在DNA-蛋白质凝胶中的AOx表现出明显增强的稳定性。该方法充分利用DNA程序组装的特点,实现了生物酶的无损物理包被以及表面固定,提高了其生物稳定性,有望应用于生物酶传感器等领域。2.基于氯化血红素(Hemin)诱导组装的DNA凝胶实现了氨基化葡萄糖氧化酶(GOx-NH2)的包载,同时构建了GOx和G4-Hemin的复合酶级联体系,实现了葡萄糖氧化与双氧水降解的级联催化。富含G4序列的DNA通过超级三明治杂交反应形成杂交双链,Hemin的加入,基于Hemin与G4序列的结合作用,触发了DNA凝胶的形成。进一步加入GOx-NH2,基于静电作用力实现了GOx的凝胶包被。酶装载效率达到73%。G4-Hemin DNA凝胶体系的过氧化氢催化能力增强增强了26倍。GOx和G4 hemin包载于凝胶中,实现了葡萄糖催化氧化和H202催化降解的反应级联。该DNA凝胶酶级联反应有望应用于生物反应器等领域。
【关键词】：固定化酶 超级三明治杂交反应 DNA凝胶 生物催化级联反应
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q814.2;O648.17
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 本文所用英文缩略词表11-12
• 第1章 绪论12-31
• 1.1 装载与固定化研究12-13
• 1.2 装载和固定化方法概述13-16
• 1.2.1 非化学结合法13-14
• 1.2.2 化学结合法14-15
• 1.2.3 包埋法15-16
• 1.3 酶的装载和固定化载体材料16-19
• 1.3.1 预制型载体材料16-18
• 1.3.2 免预制型载体材料18-19
• 1.3.3 免载体交联型载体材料19
• 1.4 DNA凝胶的研究进展19-29
• 1.4.1 DNA凝胶的概念19-22
• 1.4.2 DNA凝胶的制备与表征22-25
• 1.4.3 DNA凝胶的应用25-29
• 1.5 本文拟开展的研究工作29-31
• 第2章 自组装DNA-蛋白质凝胶用于酒精氧化酶的固定31-46
• 2.1 前言31
• 2.2 实验部分31-35
• 2.2.1 试剂与仪器31-32
• 2.2.2 DNA-蛋白质杂合凝胶的制备32-33
• 2.2.3 DNA-蛋白质凝胶用于酶固定33
• 2.2.4 AOx酶活的检测33-34
• 2.2.5 MTT生物相容性考察34
• 2.2.6 血清中的乙醇催化氧化34-35
• 2.2.7 凝胶介导酶的表面固定35
• 2.2.8 酶的生物稳定性考察35
• 2.3 结果与讨论35-44
• 2.3.1 DNA-蛋白质凝胶的自组装原理35-36
• 2.3.2 超级三明治杂交链的表征36-37
• 2.3.3 DNA-蛋白质凝胶的表征37-38
• 2.3.4 酶的凝胶装载原理38-39
• 2.3.5 酶装载于凝胶的结构表征39-41
• 2.3.6 血清中酶催化氧化乙醇41-42
• 2.3.7 凝胶介导酶的表面固定42-43
• 2.3.8 凝胶中AOx稳定性考察43-44
• 2.4 小结44-46
• 第3章 基于G4-Hemin DNA凝胶的生物酶级联反应载体研究46-61
• 3.1 前言46
• 3.2 实验部分46-51
• 3.2.1 主要仪器和试剂46-47
• 3.2.2 DNA的序列设计47-48
• 3.2.3 超级三明治杂交实验48
• 3.2.4 Hemin诱导组装G4-Hemin DNA凝胶48
• 3.2.5 G4-Hemin的双氧水催化考察48-50
• 3.2.6 G4-Hemin DNA凝胶固定GOx-NH_250-51
• 3.2.7 G4-Hemin DNA凝胶作为酶级联反应的载体51
• 3.3 结果与讨论51-60
• 3.3.1 G4-Hemin DNA凝胶构建原理51-52
• 3.3.2 DNA序列设计的软件模拟52-53
• 3.3.3 超级三明治杂交链的表征53-54
• 3.3.4 G4-Hemin DNA凝胶的催化能力考察54-55
• 3.3.5 米氏催化常数的考察55-56
• 3.3.6 GOx的阳离子化表征56-57
• 3.3.7 G4-Hemin DNA凝胶装载GOx-NH_257-59
• 3.3.8 催化酶级联反应59-60
• 3.4 小结60-61
• 结论61-62
• 参考文献62-69
• 附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录69-70
• 致谢70

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本文编号：837483