多通道毛细管色谱柱装填装置研制及初步应用

发布时间：2017-09-15 11:31

  本文关键词：多通道毛细管色谱柱装填装置研制及初步应用

  更多相关文章： 毛细管色谱柱 毛细管色谱柱装柱 糖蛋白质定量 生物质谱 金属标记

【摘要】：目前纳升级液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术已经成为蛋白质组研究的主流技术之一,液相色谱法的高效分离和质谱的高灵敏分析是提高蛋白质组的覆盖率和定量准确性的关键。而作为LC-MS分析的关键技术,液相分离的核心是液相色谱柱,它能直接决定样品的分离度进而影响定性和定量结果的准确性。选择更小粒径的填料和更长的毛细管色谱柱可以有效地提高柱效、改善分离效果。对于这类毛细管色谱柱的制备以及目前色谱柱的大规模使用,目前常用的基于气压法装填技术由于装柱压力小、速度慢,已经不能满足需求,且不同批次装填的毛细管色谱柱柱效一致性不易保证。因此,本论文介绍了一种快速装填这类毛细管色谱柱的装置,并将以此装置装填得到的毛细管色谱柱应用于蛋白质组的定性和定量中。另外,蛋白质是生命活动重要的执行者,它的糖基化修饰是一种分布最为广泛且非常重要的蛋白翻译后修饰,几乎参与了所有的生命过程而且存在于多种重大疾病中,如恶性肿瘤、糖尿病、神经系统疾病等。因此糖基化修饰蛋白的研究对临床诊断和治疗具有重要的指导作用。但是,由于糖基化修饰属于非模板合成,其微不均一性和低丰度表达给糖基化的研究带来了较大的挑战。因此,糖蛋白研究亟待一种高效快速的富集和定性定量研究方法。基于这个问题,本文提出了一种N-糖蛋白的肼化学法结合镧系金属标记相对定量的新方法。本论文由四章组成。第一章介绍了目前常用的蛋白质组学分析方法与技术及常用的毛细管色谱柱装柱方法以及存在的优缺点、适用范围,也介绍了目前国内外蛋白质组特别是糖蛋白质组的研究现状和糖蛋白特别是N-糖蛋白常用的富集及定量技术。在第二章,对于目前实验室中常用的气压装填毛细管色谱柱的方法提供压力较小,不能满足超长毛细管色谱柱及亚2μm填料的毛细管色谱柱的装柱需求,且对于填料粒径3-5μm、长15 cm左右的毛细管色谱柱装柱效率低、耗时长的问题研究人员发展了一种液压匀浆装填毛细管色谱柱的方法,即采用高压色谱泵提供压力,与匀浆罐连接实现了毛细管色谱柱高效快速地装填。但采用这种装填方法一次仅能装填一根毛细管色谱柱,装柱效率低,不能满足毛细管高效液相色谱与质谱联用技术快速发展和使用的需求。另外,不同批次装填的毛细管色谱柱,其性能稳定性不易保证。针对以上问题,我们发展了一种以液相泵提供压力,连接带有磁力搅拌的六通道匀浆装填毛细管色谱柱的新装置。采用本装置一次可以装填多达6个毛细管色谱柱。以牛血清白蛋白(bsa)的胰蛋白酶酶解肽段混合物为样本,选择峰容量、蛋白覆盖率、三个特定离子的保留时间以及毛细管色谱柱柱压为指标,在毛细管液相色谱-质谱仪联用系统上对装填的反相毛细管色谱柱的性能进行评价。在考察不同的磁力搅拌速度对色谱填料的影响时,我们发现搅拌速度过大时会使填料破碎,从而影响柱效,特别是会使毛细管色谱柱柱压明显升高;我们还分别考察了一次装填的6个毛细管色谱柱、两次装填的12个毛细管色谱柱以及一次装填1个与一次装填6个毛细管色谱柱的性能及稳定性。实验结果表明:同一批次装填的6个毛细管色谱柱的性能相近;不同批次装填的12个毛细管色谱柱的峰容量和覆盖率没有明显区别,但保留时间和毛细管色谱柱柱压稳定性较差;一次装填1个和一次装填6个毛细管色谱柱柱性能的稳定性与两次分别装填6个毛细管色谱柱的稳定性相近。即采用本装置可显著提高毛细管色谱柱的装填效率且每次装填毛细管色谱柱的个数不会对柱性能产生影响。在这些工作的基础上,我们以本装置装填填料粒径3μm、长度分别为15cm和50cm的毛细管色谱柱并以酵母蛋白酶切产物来比较柱效;装填长度都为15cm、填料粒径分别为1.8μm和3μm的毛细管色谱柱比较柱效。结果表明,更长的毛细管色谱柱和更小粒径的填料都能明显提高柱效,而我们的毛细管色谱柱装填装置可以用于高效装填这类色谱柱。第三章中介绍了一种n-糖蛋白的金属元素标记结合液质联用的相对定量方法,该方法利用酰肼反应原理将糖肽上的糖基与大环试剂dota结合,将修饰有镧系金属离子的磁性纳米颗粒用来富集修饰有大环试剂的糖肽。不同样本上修饰不同的镧系金属同时上样,质谱上分析后,通过比较信号强度达到相对定量的目的。此方法的优点在于富集与标记同时进行,能进行糖基化位点鉴定和糖蛋白相对定量。我们合成了磷酸基团修饰的磁性纳米颗粒,颗粒大小均一、表面光滑、分散性好、超顺磁性好、磷酸包覆效率高,可以在磁场的作用下和溶液分离,分离速度快、效率高,且其表面磷酸基团含量高,能结合大量的金属离子,可用于高效率富集结合有大环试剂的肽段。为避免肽段上的游离氨基干扰糖肽醛基与酰肼的反应,采用二甲基化反应封闭肽段上的游离氨基,在此选取含有赖氨酸残基的肽段进行二甲基化反应来考察,结果证明,用甲醛能将氨基端的氨基和氨基酸残基上的氨基完全封闭。以上工作合成的磷酸基团修饰的磁性纳米材料及连有酰肼的dota大环试剂都为糖蛋白的富集及定量打下基础。第四章是结论部分,对本文的工作做了归纳和总结,概括本文工作的结果及其意义。
【关键词】：毛细管色谱柱 毛细管色谱柱装柱 糖蛋白质定量 生物质谱 金属标记
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O657.7;Q503
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 第一章 前言11-20
• 1.1 蛋白质组学分析方法及技术11-12
• 1.2 毛细管色谱柱装柱技术12-13
• 1.2.1 电动填充法12
• 1.2.2 气压匀浆装填法12-13
• 1.2.3 液压匀浆装填法13
• 1.3 定量蛋白质组学13-14
• 1.4 翻译后修饰蛋白质组学14-15
• 1.5 蛋白质N-糖基化修饰研究技术15-18
• 1.5.1 蛋白质糖基化修饰简介15-16
• 1.5.2 N-糖蛋白富集技术16-17
• 1.5.3 N-糖蛋白定量技术17-18
• 1.6 本论文的研究内容及选题意义18-20
• 第二章 一种多通道毛细管色谱柱装填装置的研制20-36
• 2.1 实验部分21-24
• 2.1.1 仪器与试剂21
• 2.1.2 试验方法21-24
• 2.1.2.1 匀浆溶剂的选择21
• 2.1.2.2 磁搅拌条件的选择21
• 2.1.2.3 多通道匀浆装柱系统的设计和制造21-22
• 2.1.2.4 样品前处理22
• 2.1.2.5 毛细管色谱柱装填及柱效评价22-24
• 2.2 结果和讨论24-35
• 2.2.1 装柱匀浆溶剂的选择24-25
• 2.2.2 磁搅拌条件的考察25-26
• 2.2.3 毛细管色谱柱的性能评价26-33
• 2.2.3.1 对一批装填的一个毛细管6色谱柱的性能评价26-28
• 2.2.3.2 对一批装填的6个毛细管色谱柱的性能评价28-30
• 2.2.3.3 对两批装填的12个色谱柱的性能评价30-31
• 2.2.3.4 对一次装填1个和一次装填6个毛细管色谱柱的比较31-33
• 2.2.4 本装置的应用33-35
• 2.2.4.1 以本装置装填超长毛细管色谱柱33-34
• 2.2.4.2 以本装置装填亚2微米填料的毛细管色谱柱34-35
• 2.3 结论35-36
• 第三章N-糖蛋白金属标记结合液质联用技术相对定量方法研究36-45
• 3.1 实验部分36-39
• 3.1.1 仪器与试剂36-37
• 3.1.2 实验方法37-39
• 3.1.2.1 磷酸化修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒的合成37
• 3.1.2.2 接有大环试剂的酰肼试剂的合成37-38
• 3.1.2.3 糖肽的前处理及标记38-39
• 3.2 结果和讨论39-44
• 3.2.1 磷酸化修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒的合成及表征39-41
• 3.2.2 接有大环试剂的酰肼试剂的合成及表征41-43
• 3.2.3 模型蛋白验证糖蛋白定量方案的可行性43-44
• 3.2.3.1 二甲基化效率考察43-44
• 3.3 结论44-45
• 第四章 结论45-47
• 参考文献47-53
• 个人简历53-55
• 致谢55

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