酶法合成甘露糖-6-磷酸

发布时间：2017-09-18 03:06

  本文关键词：酶法合成甘露糖-6-磷酸

  更多相关文章： 甘露糖-6-磷酸 多聚磷酸盐 依赖多聚磷酸盐型甘露糖激酶 大肠杆菌

【摘要】：甘露糖-6-磷酸(Mannose-6-phosphate, M6P)是人体细胞内蛋白质修饰的重要磷酸化合物,在医疗领域以及化妆品领域有着广泛应用。酶催化相比于化学法具有专一性强和安全环保等优势,但催化反应所需ATP以及激酶使得生产成本较高。本论文主要目的是开发一种酶催化合成甘露糖-6-磷酸的新方法,在大肠杆菌中异源表达一种依赖多聚磷酸盐型甘露糖激酶,该酶能够利用多聚磷酸盐代替价格昂贵的ATP催化合成甘露糖-6-磷酸。论文的研究内容包括基因工程菌构建、酶学基本性质研究、蛋白表达条件优化、反应条件优化几个方面,具体工作与研究结果如下：(1)克隆了来自节杆菌(Arthrobacter sp.KM)和分枝杆菌(Mycobacterium sp.MCS)的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶基因,并构建了基因工程菌E.coli BL21(DE3) (pET28a-l7/pET28a-mp),提取胞内酶以多聚磷酸盐为磷酸供体进行甘露糖-6-磷酸的合成。(2)对分枝杆菌(Mycobacterium sp.MCS)中的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶MP的酶学基本性质进行研究,MP最适温度25℃,最适pH为8.5,最适磷酸供体为六偏磷酸钠,辅因子Mg2+的最适添加浓度为5 mM,MP对葡萄糖以及甘露糖的Km值分别为9.57 mM、203.65mM,对ATP以及六偏磷酸钠的Km值为4.62 mM、1.7 mM。(3)对节杆菌(Arthrobacter sp.KM)中的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶L7蛋白表达条件进行优化。使用TB培养基,28 ℃,0.2 mM IPTG诱导12小时后可使蛋白表达量提高3倍,单位体积发酵液产酶活量提高4.7倍,高密度发酵中3 L发酵产酶共2.25×106U。(4)对节杆菌(Arthrobacter sp.KM)中的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶L7的反应条件进行优化。当甘露糖与六偏磷酸钠摩尔比为1：3,酶液浓度0.356 mg·mL-1,30 ℃, pH 8.5的条件下反应3 h后,甘露糖转化率可达到99.8%,甘露糖-6-磷酸含量为14 g·L-1。(5)在500 mL甘露糖-6-磷酸合成体系中,当底物甘露糖的浓度为40 g·L1,酶量添加量39.3 U·g-1糖,30 ℃, pH8.5,400 rpm反应8小时后,甘露糖转化率可达75%,甘露糖-6-磷酸含量为47 g·L-1。
【关键词】：甘露糖-6-磷酸 多聚磷酸盐 依赖多聚磷酸盐型甘露糖激酶 大肠杆菌
【学位授予单位】：北京化工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TQ925;O621.3
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-20
• 第一章 绪论20-30
• 1.1 引言20
• 1.2 甘露糖-6-磷酸概述20-24
• 1.2.1 甘露糖-6-磷酸简介20-21
• 1.2.2 甘露糖-6-磷酸的作用以及应用前景21-22
• 1.2.3 甘露糖-6-磷酸合成方法22-24
• 1.3 多聚磷酸盐依赖型激酶概述24-25
• 1.3.1 多聚磷酸盐简介24
• 1.3.2 多聚磷酸盐依赖型激酶简介24-25
• 1.4 检测方法25-27
• 1.4.1 甘露糖-6-磷酸检测方法25-26
• 1.4.2 多聚磷酸盐检测方法26-27
• 1.5 糖类磷酸化合物的分离27-28
• 1.6 本论文的研究思路和内容28-30
• 第二章 基因工程菌的构建30-44
• 2.1 引言30
• 2.2 实验材料30-31
• 2.2.1 菌株质粒和引物30
• 2.2.2 培养基30-31
• 2.2.3 试剂和仪器31
• 2.3 实验方法31-36
• 2.3.1 基因的克隆与重组载体构建31-33
• 2.3.2 基因诱导表达33
• 2.3.3 粗酶制备33
• 2.3.4 SDS-PAGE蛋白电泳33-34
• 2.3.5 酶催化验证34
• 2.3.6 M6P检测34-36
• 2.4 实验结果及分析36-43
• 2.4.1 l7基因表达载体构建36
• 2.4.2 mp基因表达载体构建36
• 2.4.3 l7基因表达蛋白电泳验证36-37
• 2.4.4 mp基因表达蛋白电泳验证37-38
• 2.4.5 L7酶催化验证38-42
• 2.4.6 MP酶催化验证42-43
• 2.5 本章小结43-44
• 第三章 酶学基本性质研究44-56
• 3.1 引言44
• 3.2 实验材料44
• 3.2.1 试剂44
• 3.2.2 仪器44
• 3.3 实验方法44-47
• 3.3.1 酶的纯化44-45
• 3.3.2 酶活测定45-46
• 3.3.3 最适温度46
• 3.3.4 最适pH46
• 3.3.5 最适多聚磷酸盐供体46
• 3.3.6 二价金属离子对酶活的影响46-47
• 3.3.7 基本动力学参数47
• 3.3.8 最适底物摩尔比47
• 3.3.9 MP合成甘露糖-6-磷酸47
• 3.4 实验结果及分析47-54
• 3.4.1 最适温度47-48
• 3.4.2 最适pH48-49
• 3.4.3 最适多聚磷酸盐供体49
• 3.4.4 二价金属离子对酶活的影响49-50
• 3.4.5 基本动力学参数50-52
• 3.4.6 最适底物摩尔比52-53
• 3.4.7 MP合成甘露糖-6-磷酸53-54
• 3.5 本章小结54-56
• 第四章 蛋白表达条件优化56-70
• 4.1 引言56
• 4.2 实验材料56-57
• 4.2.1 试剂和仪器56
• 4.2.2 培养基56-57
• 4.3 实验方法57-59
• 4.3.1 L7与MP对比57
• 4.3.2 培养基优化57
• 4.3.3 诱导温度与诱导剂添加浓度优化57-58
• 4.3.4 诱导方式与诱导时间优化58
• 4.3.5 溶氧对蛋白表达的影响58
• 4.3.6 高密度发酵58-59
• 4.4 实验结果及分析59-69
• 4.4.1 L7与MP对比59
• 4.4.2 培养基优化59-61
• 4.4.3 诱导温度与诱导剂添加浓度优化61-65
• 4.4.4 诱导方式与诱导时间优化65-66
• 4.4.5 溶氧对蛋白表达的影响66-67
• 4.4.6 高密度发酵67-69
• 4.5 本章小结69-70
• 第五章 甘露糖-6-磷酸的合成70-82
• 5.1 引言70
• 5.2 实验材料70
• 5.2.1 实验试剂70
• 5.2.2 实验仪器70
• 5.3 实验方法70-73
• 5.3.1 甘露糖检测方法70
• 5.3.2 反应时间优化70-71
• 5.3.3 反应温度优化71
• 5.3.4 反应pH优化71
• 5.3.5 底物摩尔比优化71
• 5.3.6 最适缓冲溶液71-72
• 5.3.7 酶量的优化72
• 5.3.8 甘露糖-6-磷酸合成72
• 5.3.9 反应pH调控方式探索72-73
• 5.4 实验结果及分析73-80
• 5.4.1 反应时间优化73-74
• 5.4.2 反应温度优化74
• 5.4.3 反应pH优化74-75
• 5.4.4 底物摩尔比优化75-76
• 5.4.5 最适缓冲溶液76
• 5.4.6 酶量优化76-78
• 5.4.7 甘露糖-6-磷酸合成78-79
• 5.4.8 反应pH调控方式探索79-80
• 5.5 本章小结80-82
• 第六章 结论及创新点82-84
• 6.1 本文主要结论82-83
• 6.2 创新点83-84
• 附录84-88
• 参考文献88-92
• 致谢92-94
• 研究成果及发表的学术论文94-96
• 作者及导师简介96-97
• 附件97-98

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 陈笑梅;池浩超;黄超群;朱岩;朱晓雨;王雪;;沸水阻断多聚磷酸盐分解离子色谱法检测水产品中的多聚磷酸盐[J];分析化学;2008年10期

2 王扬;何辉;叶磊海;何丰;郑重莺;;在线渗析-离子色谱法测定水产品中多聚磷酸盐的研究[J];南方水产科学;2011年06期

3 杨贤庆;李来好;戚勃;陈胜军;;多聚磷酸盐在罗非鱼片中扩散规律的研究[J];食品与发酵工业;2007年07期

4 袁丽;高瑞昌;韩国良;乔荣梅;刘丽萍;;肌肉中多聚磷酸盐水解的研究进展[J];农业工程技术(农产品加工业);2008年03期

5 王雪;陈笑梅;朱岩;;离子色谱法测定冷冻水产品中的多聚磷酸盐[J];分析试验室;2008年07期

6 冯慧;薛长湖;高瑞昌;任兵兴;刘鑫;曹荣;尹利昂;;多聚磷酸盐在冷冻罗非鱼肉中的降解及其对鱼肉品质的影响[J];食品工业科技;2008年09期

7 崔晗;陈溪;黄大亮;崔妍;曹文军;杨荟;沈葆真;;离子色谱法同时测定水产品中的柠檬酸盐和多聚磷酸盐[J];分析试验室;2009年S1期

8 靳红果;彭增起;;肉中添加多聚磷酸盐的研究进展[J];肉类研究;2009年01期

9 韦小烨;林文业;邓卫利;黄文琦;黄一帆;;离子色谱法测定水产品中多聚磷酸盐的含量[J];广西科学院学报;2010年03期

10 孙亮;肖海龙;王红青;陈美春;;微波加热阻断分解后测定冻水产品中多聚磷酸盐-离子色谱法[J];中国卫生检验杂志;2010年11期

中国重要会议论文全文数据库 前6条

1 张丽;王丽;励建荣;;免试剂离子色谱法检测水产品及其制品中的多聚磷酸盐[A];中国食品科学技术学会第七届年会论文摘要集[C];2010年

2 高瑞昌;袁丽;;肌肉中多聚磷酸盐水解的研究进展[A];2007中国农业工程学会农产品加工及贮藏工程分会学术年会暨中国中部地区农产品加工产学研研讨会论文集[C];2007年

3 闫军;高峰;张锐;王碗;刘肖;;海产品中多聚磷酸盐的离子色谱法测定[A];国产科学仪器应用、创新和产业化学术研讨会论文集（一）[C];2007年

4 冯慧;薛长湖;高瑞昌;任兵兴;刘鑫;曹荣;尹利昂;;多聚磷酸盐在冷冻罗非鱼肉中的降解及其对鱼肉品质的影响[A];2007年中国水产学会学术年会暨水产微生态调控技术论坛论文摘要汇编[C];2007年

5 石廷玉;胡晓敏;郑大胜;袁志明;;多聚磷酸盐对球形芽胞杆菌生理功能的调节[A];2012年鄂粤微生物学学术年会——湖北省暨武汉微生物学会成立六十年庆祝大会论文集[C];2012年

6 苗瑞婧;高平;张旭;;利用磷酸化壳聚糖/无定形磷酸钙支架与多聚磷酸盐对深龋仿生再矿化的研究[A];天津市生物医学工程学会第三十四届学术年会论文集[C];2014年

中国博士学位论文全文数据库 前3条

1 高瑞昌;鳙鱼中多聚磷酸盐水解机理及无磷保水剂的研究[D];中国海洋大学;2007年

2 靳红果;猪肉多聚磷酸酶调控肌肉蛋白质凝胶特性的研究[D];南京农业大学;2011年

3 周吉峙;多元LDH层状双氢氧化物捕集多聚磷酸盐的机制和协同效应[D];上海大学;2011年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 岳维彦;稀土多聚磷酸盐纳米晶的制备及光学性能研究[D];南京邮电大学;2015年

2 龚靖;施氏假单胞菌TS44多聚磷酸盐外切酶(PPX)的锑抗性功能研究[D];华中农业大学;2013年

3 方位;强化生物除磷系统中胞外多聚磷酸盐特性的研究[D];中国科学技术大学;2016年

4 喻小春;酶法合成甘露糖-6-磷酸[D];北京化工大学;2016年

5 冯慧;多聚磷酸盐在冷冻罗非鱼肉中的水解以及水产品无磷保水剂的研究[D];中国海洋大学;2008年

6 许雯雯;多聚磷酸盐对养殖鲈鱼品质影响的初步研究[D];浙江工商大学;2011年

7 王莹莹;水产品中多聚磷酸盐的含量测定及风险评估[D];青岛大学;2012年

8 张丽;水产品中多聚磷酸盐离子色谱检测方法的建立及无磷保水剂的初步研究[D];浙江工商大学;2011年

9 田锐花;多聚磷酸盐对牛肉加工特性的影响研究[D];南京农业大学;2012年

10 高瑞昌;多聚磷酸盐在肌肉中水解及其对保水性影响的研究[D];河北农业大学;2004年

，

本文编号：872996