DNA自组装纳米结构在生物传感中的应用
本文关键词：DNA自组装纳米结构在生物传感中的应用
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【摘要】：沃森(Watson)和克里克(Crick)在1953年发现了DNA碱基配对原则和双螺旋结构,自此以后,分子生物学得到了飞速发展。由于DNA分子具有小巧坚固的结构,高信息量存储和特异性的碱基配对特点,使得其可以作为分子建筑模块来构建功能化的纳米材料和器件。上世纪八十年代,纽约大学的Nadrian C.Seeman教授开创了DNA纳米自组装技术,该技术利用DNA分子作为组装模块材料,通过自下至上的方式,组装出了许多有确定几何结构的纳米级物体。随后,在过去的三十年里,一系列可寻址的一维,二维以及三维的DNA纳米结构接连创造了出来,然而,发展具有功能性的确定几何外形的DNA纳米结构却是一个亟待解决的问题。现阶段报道的DNA纳米结构仅处于模型阶段,而它的生物应用还处于萌芽阶段,本论文基于DNA自组装形成的新型纳米结构并运用于生物传感,开发出了低成本、操作简便以及高灵敏的新型纳米生物传感器。1.RNA调控的分子钳子灵敏检测癌细胞中microRNA基于DNA钳子纳米探针,本文构建了一种免酶且高选择性的生物传感器用于前列腺癌细胞中microRNA(miR-141)的检测。我们用非变性凝胶电泳表征了自组装形成的DNA钳子的调控能力。当加入燃料链,即目标物microRNA的时候,钳子机器装置迫使被关闭,导致荧光淬灭。当加入抗燃料链时,目标物被置换出来,并释放出支架链,钳子机器重新回到打开的状态荧光恢复。体系中只要交替的加入目标链和抗燃料链,该装置就会循环往复的进行打开/关闭的操作。目标物miR-141对DNA钳子纳米机器的调控能力与其浓度成线性关系,因此,能够用于检测miR-141,检测限可低至0.6 pmol.L-1。体系中设计操作的DNA钳子纳米机器是基于toehold介导的链置换反应,具有很强的特异性,能够在成分复杂的细胞裂解液中检测出目标物。2.MicroRNA诱导催化自组装DNA纳米结构灵敏检测癌细胞中microRNA通过联合杂交链式反应(HCR)和T-连接内聚(T-junction cohesion)自组装方式,我们成功的组装出一个具有36±8 nm的DNA纳米轮,组装过程中设计的toehold介导的链置换反应,使得目标物miR-141得以循环使用,从而实现了从肿瘤细胞中超灵敏的检测miR-141,检测限达到261个细胞。本体系中,避免了使用酶和制备复杂的纳米材料,稳定性得到了很大的提升,和传统报道的基于DNA折纸自组装方式不同的是,实验过程中仅仅涉及到四条DNA链,避免了复杂且耗时的DNA链设计过程,同时也节约了实验成本。DNA自组装形成的纳米轮具有高的选择性,能够实现单碱基错配检测,因此能够运用于不同的生物标志物的检测。3.末端保护的小分子链接的ssDNA用于游离且灵敏的比色法检测叶酸受体小分子/蛋白之间的特异性作用在药物研发,医学临床诊断,生物蛋白代谢之间的相互作用起着至关重要的作用。利用叶酸(FA)和叶酸受体(FR)之间的特异性结合性质,此体系设计了一种便捷高效且灵敏的比色生物传感器用于检测生物标志物,叶酸受体蛋白。传感器的设计原理是依靠末端保护的FA连接的单链DNA(ssDNA)引发自组装形成的DNAzyme聚合物进行信号放大检测。目标蛋白FR通过特异性结合作用与连接在ssDNA上的FA结合,结合FR的FA-ssDNA探针能抵制Exo I的水解。受到保护的单链DNA能引发两个包含G四倍体序列的发夹DNA自组装形成DNAzyme聚合物,从而使得溶液的颜色发生显著的变化达到免标记且灵敏的比色检测FR的目的。通过聚丙烯凝胶电泳我们证明了末端保护的ssDNA触发自组装形成的DNAzyme聚合物,对实验参数也进行了优化。在最优实验条件下,能用紫外吸收光谱仪检测到0.35 pmol.L-1的FR,而能用肉眼直接检测到5 pmol.L-1的FR。研发的传感器具有很高的选择性能在干扰物质中特异性识别出目标物,并能在血清样品中检测目标物,这使得设计的末端保护自组装传感器能用于检测不同类型的小分子/蛋白之间的相互作用。4.基于未修饰的适体和DNAzyme用以目标循环放大检测ATP基于目标循环放大的方法,我们利用未修饰的适体和DNAzyme构建了一种免标记的,简单灵敏的比色ATP检测方法。目标物ATP和双链DNA探针中的适体特异性结合,导致G四倍体链的释放。ATP结合适体后被Exo III降解,释放出目标物ATP,释放出的ATP可再次与双链DNA探针中的适体链相结合,到达目标循环放大的目的。由于目标分子的循环扩增,被释放的G四倍体序列链的量显著增加。随后,释放出的G四倍体链与hemin结合,形成hemin/G四倍体DNAzyme,使得探针溶液的颜色发生剧烈变化,从而实现了灵敏的比色检测ATP,检测限低至0.33 nmol.L-1。我们构建的传感器显示出良好的选择性,并且可以在均相溶液中进行检测,这使得我们的检测方法在灵敏的比色检测小分子和蛋白质方面具有良好的应用前景。
【关键词】：DNA自组装 DNA纳米结构 信号放大 生物传感
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O657.3;TP212
【目录】：
- 摘要6-8
- ABSTRACT8-11
- 第一章 绪论11-27
- 1.1 瓦块模式自组装DNA纳米结构11-15
- 1.1.1 Holliday交叉结(Holliday junction)12
- 1.1.2 DNA双交叉结构(DNA double-crossover, DX)12-13
- 1.1.3 十字瓦块(four-arm junctions)和多角形瓦块13-14
- 1.1.4 单链组装模块14-15
- 1.1.5 T形组装瓦块（T-junction motif）15
- 1.2 DNA折纸术(DNA origami)15-16
- 1.3 信号放大技术在DNA纳米结构中的应用16-25
- 1.3.1 基于酶催化的信号放大策略16-18
- 1.3.2 基于链置换信号放大方法18-21
- 1.3.3 基于纳米材料的信号放大21-25
- 1.4 本论文研究背景及意义25-27
- 第二章 RNA调控的分子钳子灵敏检测癌细胞中micro RNA27-35
- 2.1 前言27-28
- 2.2 实验部分28-29
- 2.2.1 材料及试剂28-29
- 2.2.2 制备的miR-141调控操作的DNA钳子29
- 2.2.3 非变性凝胶电泳29
- 2.2.4 细胞培养以及制备的细胞裂解液29
- 2.2.5 实验仪器29
- 2.3 结果与讨论29-34
- 2.3.1 miR-141调控操作的DNA钳子工作原理29-30
- 2.3.2 miR-141调控的DNA钳子机器的特征30-32
- 2.3.3 DNA钳子应用于检测miR-14132-33
- 2.3.4 从不同的癌细胞提取物中检测miR-14133-34
- 2.4 总结34-35
- 第三章 microRNA诱导催化自组装DNA纳米结构灵敏检测癌细胞中的microRNA35-45
- 3.1 前言35-36
- 3.2 实验部分36-38
- 3.2.1 材料与试剂36-37
- 3.2.2 琼脂糖凝胶电泳37
- 3.2.3 聚丙型凝胶电泳37
- 3.2.4 细胞培养及制备的RNA提取液37
- 3.2.5 MicroRNA触发DNA纳米结构的形成过程37-38
- 3.2.6 原子力显微成像（AFM）38
- 3.2.7 动态光散射（DLS）38
- 3.2.8 荧光测量38
- 3.3 结果与讨论38-44
- 3.3.1 miR-141触发自组装形成的DNA纳米环的原理图38-39
- 3.3.2 miR-141诱导自组装DNA纳米环的可行性分析39-41
- 3.3.3 实验条件的优化41-42
- 3.3.4 DNA纳米环对目标miR-141的响应性能42-43
- 3.3.5 DNA纳米环选择性研究43
- 3.3.6 细胞样品检测43-44
- 3.4 总结44-45
- 第四章 末端保护的小分子链接的ssDNA用于游离且灵敏的比色法检测叶酸受体45-53
- 4.1 前言45-46
- 4.2 实验部分46-47
- 4.2.1 实验试剂46
- 4.2.2 制备的FA-ssDNA46-47
- 4.2.3 末端保护的信号放大比色法检测FR47
- 4.2.4 非变性凝胶电泳(PAGE)47
- 4.2.5 实验仪器47
- 4.3 结果与讨论47-52
- 4.3.1 末端保护的自组装DNAzyme灵敏检测FR的原理图47-48
- 4.3.2 末端保护自组装形成的DNAzyme可行性分析48-50
- 4.3.3 传感器的性能研究50-51
- 4.3.4 血清样品中FR的检测51-52
- 4.4 总结52-53
- 第五章 基于未修饰的适体和DNAzyme用以目标循环放大检测ATP53-60
- 5.1 前言53-54
- 5.2 实验部分54-55
- 5.2.1 实验试剂54
- 5.2.2 实验仪器54-55
- 5.2.3 传感器的构建过程55
- 5.3 结果与讨论55-59
- 5.3.1 基于未修饰的适体和DNAzyme用以目标循环放大的检测ATP的机理55-56
- 5.3.2 比色法检测ATP可行性分析56
- 5.3.3 实验条件的优化56-57
- 5.3.4 ATP适体传感器性能研究57-58
- 5.3.4.1 传感器对目标物ATP的定量分析行为57-58
- 5.3.4.2 传感器的选择性58
- 5.3.5 传感器在实际样品中的应用58-59
- 5.4 总结59-60
- 参考文献60-70
- 在学期间发表的文章70-71
- 致谢71
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