基于微流控系统的高通量蛋白质结晶筛选新方法研究

发布时间：2017-09-24 15:44

  本文关键词：基于微流控系统的高通量蛋白质结晶筛选新方法研究

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【摘要】：迄今,X射线晶体学是解析蛋白质结构的主要研究手段,而获得高质量的蛋白质晶体仍需要大量实验的筛选。微流控技术因具有高通量、低耗费、集成化和促进结晶等优势,而为蛋白质结晶筛选提供了可靠的方法。第一章阐述了蛋白质结晶筛选的主要方法、商品化的蛋白质结晶平台及发展趋势；探讨了目前基于微流控技术的蛋白质结晶筛选技术和所采用的方法；介绍了近几年3D打印技术在微流控系统的应用。第二章中,我们发展了一种基于3D打印微孔阵列芯片和液滴技术的纳升级蒸气扩散蛋白质结晶和筛选方法。我们利用3D打印技术加工了具有不同体积微孔的微孔阵列芯片；发展了针对3D打印芯片内部微孔隙的后处理技术和具有多层结构的3D打印芯片密封体系,从而获得完全密封的结晶微腔室；最终结合本实验室的液滴操纵技术,实现了纳升级蒸气扩散蛋白质结晶和筛选。其蛋白消耗量比常规体系下蒸气扩散蛋白质结晶每次试验消耗的蛋白质溶液降低了10-100倍。第三章中,我们发展了一种蛋白质结晶筛选的新方法——高分辨微批量法。该方法通过在毛细管内形成可控的蛋白质浓度梯度溶液,结合本实验室的液滴阵列机器人技术,在玻璃芯片上形成大规模的蛋白质浓度梯度液滴,从而进行高分辨微批量法蛋白质结晶筛选。我们应用商品化蛋白结晶筛选试剂盒提供的480种结晶条件对五种蛋白进行了筛选,使用12种蛋白浓度筛选一个条件仅消耗蛋白样品40 nL。
【关键词】：微流控学 蛋白质结晶 3D打印技术 浓度梯度 高通量筛选
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O629.73
【目录】：

• 致谢5-7
• 摘要7-8
• ABSTRUCT8-14
• 第一章 绪论14-55
• 1.1 蛋白质结晶及其筛选方法14-16
• 1.1.1 蛋白质结构测定和蛋白质结晶14-15
• 1.1.2 常用的蛋白质结晶筛选方法15-16
• 1.2 商业化蛋白质结晶筛选仪器16-34
• 1.2.1 商业蛋白质结晶筛选机器人17-29
• 1.2.1.1 开放式液体操纵机器人平台及改装18-19
• 1.2.1.2 Digilab公司的HoneyBee系列19-21
• 1.2.1.3 Douglas Instruments公司的Oryx系列21-22
• 1.2.1.4 TTPlabtech公司的Mosquito系列22-24
• 1.2.1.5 ARI公司的Phoenix和Gryphon结晶筛选机器人24-27
• 1.2.1.6 Formulatrix公司的Formulator和Mantis仪器27-29
• 1.2.2 其他可用于蛋白质结晶筛选的通用型液体操纵平台29-34
• 1.2.2.1 Formulatrix公司的NT830-31
• 1.2.2.2 Hamilton公司的Microlab STAR和VANTAGE系统31-33
• 1.2.2.3 Tecan公司的Freedom EVO和Fluent实验室自动化方案33-34
• 1.3 基于微流控技术的蛋白质结晶和筛选34-43
• 1.3.1 PDMS微泵微阀技术35-37
• 1.3.2 液滴技术37-40
• 1.3.3 滑动芯片40-41
• 1.3.4 树型逆向扩散芯片41-42
• 1.3.5 离心力驱动芯片42-43
• 1.4 常见3D打印技术及其在微流控领域的应用43-48
• 1.4.1 光固化立体造型及相关技术45-46
• 1.4.2 选择性激光烧结46-47
• 1.4.3 熔融沉积造型47-48
• 1.4.4 喷墨打印48
• 1.5 小结和选题意义48-49
• 1.6 参考文献49-55
• 第二章 基于3D打印微孔阵列芯片和液滴技术的蒸气扩散蛋白质结晶系统的研究55-79
• 2.1 引言55-56
• 2.2 实验部分56-64
• 2.2.1 试剂与材料57
• 2.2.2 仪器设备57-58
• 2.2.3 微孔芯片的设计和处理58-60
• 2.2.4 3D打印微孔芯片的表征和性能测试60
• 2.2.5 毛细管取样针的制备60
• 2.2.6 蒸气扩散体系的验证和条件优化60-62
• 2.2.7 不同体积的液滴蒸气扩散速度研究62
• 2.2.8 蛋白质结晶和筛选过程62-64
• 2.3 结果与讨论64-75
• 2.3.1 系统设计65-68
• 2.3.1.1 3D打印微孔芯片的设计和加工65-67
• 2.3.1.2 密封体系的形成67-68
• 2.3.1.3 结晶液滴蒸气扩散速率的控制方法68
• 2.3.2 3D打印芯片的石蜡填充和表面处理结果68-70
• 2.3.3 蒸气扩散体系的可行性和影响因素研究70-72
• 2.3.3.1 结晶液滴和沉淀剂孔中不同盐浓度比的影响71-72
• 2.3.3.2 结晶孔中不同油量对液滴失水速率的影响72
• 2.3.4 纳升级液滴中的蒸气扩散蛋白质结晶和筛选72-75
• 2.3.4.1 不同浓度溶菌酶的微批量法和蒸气扩散结晶结果对比72-74
• 2.3.4.2 溶菌酶和胰蛋白酶的蒸气扩散结晶筛选74-75
• 2.4 结论及展望75-76
• 2.5 参考文献76-79
• 第三章 基于微流控浓度梯度液滴阵列技术的蛋白质结晶高通量筛选方法的研究79-111
• 3.1 引言79-81
• 3.2 实验部分81-87
• 3.2.1 试剂与材料81-82
• 3.2.2 仪器设备82-83
• 3.2.3 微阵列芯片的设计和制作83
• 3.2.4 浓度梯度的形成和条件试验83-85
• 3.2.5 大规模、高通量蛋白质结晶和筛选85-87
• 3.2.6 微体积浓度梯度蛋白质结晶与常规体积对比87
• 3.3 实验装置的优化、改进以及初步评测87-92
• 3.3.1 全自动液滴阵列机器人和性能调试87-90
• 3.3.1.1 第二代全自动液滴阵列机器人及性能87-90
• 3.3.2 编码型微孔阵列玻璃芯片的设计和优化90-92
• 3.3.2.1 编码型微孔阵列玻璃芯片的设计90-91
• 3.3.2.2 PMMA框与玻璃芯片黏合剂及耐油试验91-92
• 3.4 结果与讨论92-107
• 3.4.1 蛋白液滴浓度梯度阵列的FITC-葡聚糖模拟93
• 3.4.2 液滴浓度梯度阵列的影响条件和优化93-95
• 3.4.2.1 不同样品量对浓度梯度的影响93-94
• 3.4.2.2 不同缓冲液量对浓度梯度的影响94-95
• 3.4.2.3 样品及缓冲液用量的条件选择和优化95
• 3.4.3 基于液滴浓度梯度技术的大规模蛋白质结晶条件筛选95-106
• 3.4.3.1 溶菌酶结晶条件筛选95-98
• 3.4.3.2 胰蛋白酶结晶条件筛选98-101
• 3.4.3.3 葡萄糖异构酶的结晶条件筛选101-104
• 3.4.3.4 索马甜蛋白结晶条件筛选104-106
• 3.4.4 微体积浓度梯度蛋白质结晶与常规体积对比106-107
• 3.5 结论及展望107-108
• 3.6 参考文献108-111
• 附录111-128
• 作者简历128

【参考文献】

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1 ;Microfluidic System for Synthesis of Trigonal Selenium Nanowires[J];Chemical Research in Chinese Universities;2010年04期

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本文编号：912261