聚乙烯亚胺对辣根过氧化物酶与乳酸脱氢酶构象和活性的影响

发布时间：2017-09-30 18:34

  本文关键词：聚乙烯亚胺对辣根过氧化物酶与乳酸脱氢酶构象和活性的影响

  更多相关文章： 聚乙烯亚胺 辣根过氧化物酶 乳酸脱氢酶 构象变化 相互作用 催化活性 热稳定性 热力学参数

【摘要】：近年来,聚乙烯亚胺(PEI)基因载体材料由于其良好的转染效率而备受基因工程界的青睐,但其潜在的安全性理论依据尚不明确,尤其是对功能性蛋白(如酶)的影响机理还缺乏统一的认识。本文运用紫外吸收光谱、荧光光谱、圆二色谱等光谱学手段,酶促反应动力学方法以及ITC技术研究了聚乙烯亚胺对辣根过氧化物酶(HRP)和乳酸脱氢酶(LDH)的构象、催化活性、热稳定性以及酶促反应动力学的影响,对PEI与两种蛋白质之间的相互作用机理进行了探讨,为PEI作为基因载体材料的安全性研究提供一定的理论依据。本研究结果如下：PEI对HRP的构象和功能均有显著影响。(1)PEI的存在主要影响蛋白质分子的三级结构,对蛋白质的二级结构影响程度有限,对于构象的影响可能是PEI与HRP形成了复合物,引起肽链骨架发生变化,色氨酸和酪氨酸残基附近微区环境的疏水性及两种氨基酸在极性环境中的暴露程度发生了改变；(2)PEI可以增强HRP在模拟生理溶液中的催化活性,同时其酶催化反应动力学参数Km和Vmax也发生了变化,但其耐高温能力有所削弱；(3)根据ITC结果显示PEI与HRP间的相互作用表现出显著的热效应,PEI与HRP间相互作用过程中,第一步△H10,AS10,而第二步△H20,△S20,故PEI与HRP之间的相互作用主要由疏水作用力、氢键和范德华力起主导作用。LDH在模拟生理溶液中的构象和催化功能也因PEI的存在发生了明显变化。(1)在30℃测定条件下,PEI的加入可使LDH的催化活性显著降低,酶催化反应动力学参数Km和Vmax也发生相应变化,与此同时LDH的耐热稳定性也出现明显削弱；(2)与HRP不同的是PEI的加入不仅导致LDH二级结构增强,同时三级结构也有显著影响,色氨酸和酪氨酸残基附近微区环境变化十分剧烈,两种氨基酸基团在极性溶剂中的暴露程度也有所改变,LDH与PEI之间很可能形成了复合物；(3)从ITC结果来看,PEI与LDH结合的过程为一个吸热过程,其△H0,AS0,说明PEI与LDH之问的相互作用主要为疏水相互作用,并且是一个熵驱动的过程。
【关键词】：聚乙烯亚胺 辣根过氧化物酶 乳酸脱氢酶 构象变化 相互作用 催化活性 热稳定性 热力学参数
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O629.8;O643.1
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 符号说明11-12
• 第一章 绪论12-25
• 1.1 研究背景12-13
• 1.2 聚乙烯亚胺基因载体材料13-14
• 1.3 聚乙烯亚胺与蛋白质相互作用研究进展14-15
• 1.4 辣根过氧化物酶15-19
• 1.5 乳酸脱氢酶19-21
• 1.6 选题思路及主要内容21-25
• 1.6.1 研究思路21-23
• 1.6.2 主要内容23-25
• 第二章 聚乙烯亚胺对辣根过氧化物酶构象和活性的影响25-45
• 2.1 引言25
• 2.2 试验部分25-30
• 2.2.1 主要试剂材料与仪器设备25-26
• 2.2.2 储备液的配制26-27
• 2.2.3 紫外光谱扫描27-28
• 2.2.4 圆二色谱测定28
• 2.2.5 荧光光谱的检测28
• 2.2.6 辣根过氧化物酶的活性测定28-29
• 2.2.7 辣根过氧化物酶的热稳定性检测29
• 2.2.8 反应动力学参数的测定29-30
• 2.2.9 ITC30
• 2.3 结果与讨论30-44
• 2.3.1 紫外吸收光谱30-31
• 2.3.2 圆二色谱31-32
• 2.3.3 荧光光谱32-37
• 2.3.4 等温滴定量热分析37-40
• 2.3.5 PEI对HRP催化活性的影响40-41
• 2.3.6 酶促反应动力学分析41-43
• 2.3.7 PEI对HRP热稳定性的影响43-44
• 2.4 本章小结44-45
• 第三章 聚乙烯亚胺对乳酸脱氢酶构象和活性的影响45-65
• 3.1 引言45-46
• 3.2 试验部分46-49
• 3.2.1 主要试剂材料与仪器设备46
• 3.2.2 溶液的配制46-47
• 3.2.3 紫外光谱检测47
• 3.2.4 圆二色谱扫描47
• 3.2.5 荧光光谱的测定47-48
• 3.2.6 乳酸脱氢酶的活性测定48
• 3.2.7 乳酸脱氢酶的热稳定性检测48
• 3.2.8 反应动力学参数的测定48-49
• 3.2.9 ITC49
• 3.3 结果与讨论49-63
• 3.3.1 紫外吸收光谱49-51
• 3.3.2 圆二色谱51-52
• 3.3.3 荧光光谱52-57
• 3.3.4 等温滴定量热分析57-60
• 3.3.5 PEI对LDH催化活性的影响60-61
• 3.3.6 酶促反应动力学分析61-62
• 3.3.7 PEI对LDH热稳定性的影响62-63
• 3.4 本章小结63-65
• 第四章 结论与展望65-67
• 4.1 结论65-66
• 4.2 展望66-67
• 参考文献67-79
• 致谢79-80
• 攻读硕士学位期间发表学术论文目录80

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