分子改造提高酸性α-淀粉酶热稳定性

发布时间：2017-10-02 00:17

  本文关键词：分子改造提高酸性α-淀粉酶热稳定性

  更多相关文章： 酸性α-淀粉酶 热稳定性 定点突变 分泌表达 纯化 酶学性质

【摘要】：本文主要目的是通过分子改造提高深海嗜热菌Geobacillus sp.4j来源的酸性a-淀粉酶Gs4j-AmyA的热稳定性。基于前人对BLA (Bacillus lecheniformis α-淀粉酶)和BStA (Bacillus stearothermophilus α-淀粉酶)的热稳定性位点的研究,选出11个氨基酸位点进行突变,并在大肠杆菌中进行了分泌表达。根据实验结果,初步筛选出四个热稳定性提高的突变α-淀粉酶RGI179-181Q、IG181-182* C363G、N463T,并进行IG181-182*/C363G和IG181-182*/N463T组合突变。通过优化纯化条件,最终通过超滤和镍柱纯化的方法得到电泳纯的原始酶和突变酶。为了探究突变酶的热稳定性,分别测定了原始酶和突变酶在70℃、85℃、95℃C温度下的半衰期。突变酶RGl179-181Q和IG181-182*在70℃下的半衰期分别是原始淀粉酶的59倍和63倍,热稳定性得到极大的提高。单突变酶C363G和N463T的半衰期与原始淀粉酶相比基本没有提升,C363G仅在70℃时半衰期较原始淀粉酶提高了21%,而N463T在85℃和95℃时的半衰期分别下降了6.2%和34%。然而,组合突变IG181-182*/C363G和IG181-182*/N463T在70℃的半衰期分别在IG181-182*突变酶的基础上提高了17%和39%。突变酶和原始淀粉酶的最适温度(65～70℃)和最适pH(5.5～5.6)基本相同。与原始淀粉酶相比,四个突变酶C363G, N463T, IG181-182*/C363G和IG181-182*/N463T的催化效率分别下降了59%、50%、37%、16%。但突变酶RGl179-181Q和IG181-182*的催化效率和原始淀粉酶基本相同,为40×105min-1左右。通过对同源建模得到的分子结构模型分析发现,IG181-182两个氨基酸的缺失突变使得Ca2+结合网络增强,这可能是IG181-182*突变酶热稳定性增强的重要原因。N463T突变使得该位点的氢键数量减少(5变成了3),这可能是单突变酶N463T热稳定性下降的主要原因。
【关键词】：酸性α-淀粉酶 热稳定性 定点突变 分泌表达 纯化 酶学性质
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O629.8
【目录】：

• 摘要5-6
• abstract6-11
• 第1章 文献综述11-26
• 1.1 淀粉酶11-16
• 1.1.1 淀粉酶的分类11
• 1.1.2 酸性α-淀粉酶的工业应用11-14
• 1.1.3 酸性α-淀粉酶结构及保守域14-16
• 1.2 酸性α-淀粉酶的耐热性16-19
• 1.2.1 酸性α-淀粉酶的耐热机理16-17
• 1.2.2 淀粉酶热稳定性相关位点17-19
• 1.3 酶的定向改造方法19-21
• 1.3.1 酶的非理性设计19-20
• 1.3.2 酶的理性设计20-21
• 1.4 基因定点突变技术原理与方法21-24
• 1.4.1 寡核苷酸定向诱变22-23
• 1.4.2 盒式诱变23
• 1.4.3 重叠延伸PCR23
• 1.4.4 全质粒扩增诱变23-24
• 1.5 本课题研究目的及意义24-26
• 第2章 热稳定性提高的酸性α-淀粉酶的初步筛选26-38
• 2.1 前言26
• 2.2 实验材料和方法26-31
• 2.2.1 菌株、质粒和试剂26-27
• 2.2.2 确定热稳定性相关位点的方法27
• 2.2.3 大肠杆菌感受态制备27-28
• 2.2.4 大肠杆菌转化28
• 2.2.5 突变α-淀粉酶基因28-30
• 2.2.6 突变酶在大肠杆菌中诱导表达30
• 2.2.7 DNS试剂测还原糖含量标准曲线30-31
• 2.2.8 α-淀粉酶的酶活力测定31
• 2.2.9 初筛热稳定性提高的α-淀粉酶31
• 2.3 结果与讨论31-37
• 2.3.1 确定热稳定性相关位点31-34
• 2.3.2 突变α-淀粉酶基因34-36
• 2.3.3 初筛热稳定性提高的突变α-淀粉酶36-37
• 2.4 本章小结37-38
• 第3章 热稳定性提高的突变酶的纯化及酶学性质38-54
• 3.1 前言38
• 3.2 实验材料38-39
• 3.3 实验方法39-42
• 3.3.1 突变酶在大肠杆菌中诱导表达39
• 3.3.2 淀粉酶蛋白纯化39-40
• 3.3.3 蛋白SDS-PAGE方法40
• 3.3.4 Bradford法测蛋白浓度40-41
• 3.3.6 α-淀粉酶的酶动力学参数测定41
• 3.3.7 淀粉酶半衰期测定方法41-42
• 3.3.8 最适温度和最适pH测定42
• 3.4 结果和讨论42-53
• 3.4.1 原始酶纯化条件优化42-44
• 3.4.2 突变酶的蛋白纯化44-47
• 3.4.3 纯化倍数和回收率计算47-49
• 3.4.4 不同温度下的半衰期49-51
• 3.4.5 最适温度和最适pH值51
• 3.4.6 酶动力学参数51-53
• 3.5 本章小结53-54
• 第4章 同源建模和热稳定性相关位点分析54-59
• 4.1 前言54
• 4.2 实验方法54
• 4.3 结果与讨论54-58
• 4.3.1 同源建模得三维结构模型54-55
• 4.3.2 IG181-182~*突变位点分析55-56
• 4.3.3 C363G和N463T突变位点分析56-57
• 4.3.4 催化效率下降的原因分析57-58
• 4.4 本章小结58-59
• 第5章 总结与展望59-61
• 5.1 全文总结59-60
• 5.2 创新点60
• 5.3 展望60-61
• 参考文献61-66
• 论文发表66-67
• 致谢67

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本文编号：956481