表面增强拉曼信号放大生物传感方法在生物活性分子检测中的应用

发布时间：2017-10-08 04:04

  本文关键词：表面增强拉曼信号放大生物传感方法在生物活性分子检测中的应用

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【摘要】：在肿瘤等重大疾病生物检测方面,蛋白质以及核酸都是非常重要的生物分子标记物,而在疾病早期这些生物分子的含量很低,难以检测。建立高灵敏高选择性的生物分子标记物的检测手段,对于疾病的早期诊断和治疗方面将有很大的帮助。本文结合纳米金生物条码放大技术,采用表面增强拉曼技术,构建了双前体自产生聚合酶剪切循环、对称信号放大同时检测以及不对称信号放大同时检测方法,实现了对血小板衍生因子PDGF-BB、癌症标记物miRNA-203和ATP生物活性分子的高灵敏高选择性检测。本工作主要包括以下三个方面:1、根据适体与靶分子特异性识别的特点,本实验构建了一种基于前体自产生的聚合酶链取代放大拉曼信号检测PDGF-BB的方法,该方法根据PDGF-BB适体的特殊结构,当适体与靶分子结合后,可形成发夹DNA结构,同时与适体互补的DNA链解旋后自动形成另一条发卡DNA链,两条发夹DNA的一端以自身为模板,进行聚合酶链取代循环放大反应,释放大量的单链DNA,进而引发下一步的聚合酶链取代循环放大反应,最后在作为基底的金片上固定了大量的纳米金生物条码,以达到再次放大信号的作用,从而提高检测的灵敏度,其检测限为0.42 pM。该方法易于操作,具有良好的选择性和灵敏性,为蛋白质等生物活性小分子的检测提供了新的思路。2、miRNA-203和ATP是癌症诊断的重要生物分子,我们设计了一种对称信号放大同时检测的方案,通过杂交链式反应以及生物条码技术二次放大检测信号,制备了一种双功能生物分子拉曼探针同时检测miR-203和ATP分子,该方法利用磁珠作为载体,将含有两种分子识别链的DNA链及其互补链固定在磁珠上,当两种分子存在时,分别与识别链发生特异性绑定,同时将两种引发链释放到体系中,进而引发下一步的杂交链式反应,同时通过碱基互补配对原则将两种生物条码大量固定到磁珠上,以金片作为基底检测拉曼信号,ATP的检测限为5.6×10-9 M,miRNA-203的检测限为1.2×10-14 M。本方案对于两种分子具有较好的选择性和灵敏度,为同时检测多组份提供了可行的检测方法。3、同时检测多种重大疾病相关的生物活性分子,可提高疾病早期的检出率。对于体内浓度差异较大的多组分活性分子,高浓度的分子响应信号易于掩盖低浓度的分子响应信号,影响低浓度分子检测的准确性。为进一步提高体内浓度水平差异较大的双组份检测的稳定性和灵敏度,我们在上一部分的基础上进行了不对称同时放大检测,对于浓度较高的ATP使用生物条码技术进行一次信号放大,对于浓度较低的miR-203利用杂交链式反应反应和生物条码技术进行二次信号放大。通过对实际样品癌症细胞和正常细胞中两种组份的灵敏检测,充分说明了该方案具有较好的实用性。本方法提高了浓度水平差异较大的双组分检测的准确性。ATP的检测限20 nM,miRNA-203的检测限为1.5 fM。该方案无需使用工具酶,因此反应简单,易于操作,多组份的同时检测为癌症诊断提供了更精确的分析,在肿瘤分析方面具有更广阔的应用前景。
【关键词】：信号放大 DNA适体 表面增强拉曼散射 纳米金生物条码
【学位授予单位】：青岛科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TP212.3;O657.37
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 第一章 前言10-28
• 1.1 DNA生物传感方法10-16
• 1.1.1 核酸适体10-11
• 1.1.2 生物传感方法11-12
• 1.1.3 DNA生物传感方法的分类12-16
• 1.2 DNA循环放大技术16-22
• 1.2.1 杂交链式反应16-17
• 1.2.2 链取代放大反应17-18
• 1.2.3 聚合酶链式反应18-19
• 1.2.4 聚合酶链置换反应19-20
• 1.2.5 滚换复制放大反应20-22
• 1.3 表面增强拉曼散射22-26
• 1.3.1 拉曼散射简介22-23
• 1.3.2 拉曼散射光谱的特点23
• 1.3.3 拉曼散射光谱的应用23-24
• 1.3.4 表面增强拉曼散射简介24-25
• 1.3.5 表面增强拉曼散射的应用25-26
• 1.4 本工作的研究内容以及研究意义26-28
• 第二章 双前体自产生表面增强拉曼信号放大分析检测PDGF-BB28-44
• 2.1 引言28-29
• 2.2 实验部分29-32
• 2.2.1 试剂29-30
• 2.2.2 仪器30
• 2.2.3 纳米金颗粒的制备30-31
• 2.2.4 生物条码的制备31
• 2.2.5 发卡DNA链在金片上的固定31
• 2.2.6 适体互补DNA在磁性微球上的固定31-32
• 2.2.7 前体自产生表面增强拉曼信号放大反应32
• 2.2.8 SERS检测32
• 2.3 结果与讨论32-42
• 2.3.1 实验方案原理32-34
• 2.3.2 生物条码的紫外-可见光表征34-35
• 2.3.3 纳米金颗粒的电子透射显微镜表征35
• 2.3.4 可行性实验35-36
• 2.3.5 实验条件优化36-39
• 2.3.5.1 反应体系温度的优化37
• 2.3.5.2 缓冲溶液pH的优化37-38
• 2.3.5.3 聚合酶和内切酶用量的优化38
• 2.3.5.4 反应时间的优化38-39
• 2.3.6 PDGF-BB的灵敏度检测39-40
• 2.3.7 选择性实验40-41
• 2.3.8 检测PDGF-BB的实际应用41-42
• 2.4 小结42-44
• 第三章 对称信号放大同时检测双组分癌症标记物44-55
• 3.1 引言44
• 3.2 实验部分44-47
• 3.2.1 试剂44-45
• 3.2.2 仪器45-46
• 3.2.3 纳米金颗粒的制备46
• 3.2.4 生物条码的制备46
• 3.2.5 发卡DNA（H1、H7）和适体DNA1在磁珠上的固定46
• 3.2.6 miRNA和ATP的对称信号放大同时分析46-47
• 3.2.7 SERS检测47
• 3.3 结果与讨论47-54
• 3.3.1 实验原理47-48
• 3.3.2 纳米金颗粒的TEM表征48
• 3.3.3 生物条码的紫外-可见光谱表征48-49
• 3.3.4 实验条件优化49-51
• 3.3.4.1 HCR反应时间的优化49-50
• 3.3.4.2 HCR反应温度的优化50
• 3.3.4.3 缓冲溶液pH值的优化50-51
• 3.3.5 miRNA和ATP的单独SERS检测51-52
• 3.3.6 miR-203和ATP的同时对称SERS检测52-53
• 3.3.7 选择性实验53-54
• 3.4 小结54-55
• 第四章 不对称信号放大同时检测双组份高浓度差异癌症标记物55-65
• 4.1 引言55
• 4.2 实验部分55-58
• 4.2.1 试剂55-57
• 4.2.2 仪器57
• 4.2.3 纳米金颗粒的制备57
• 4.2.4 生物条码的制备57
• 4.2.5 发卡DNA（H1、H2）和适体DNA1在磁珠上的固定57
• 4.2.6 miR-203和ATP的同时不对称检测57-58
• 4.2.7 SERS检测58
• 4.3 结果与讨论58-64
• 4.3.1 设计方案及工作原理58-60
• 4.3.2 纳米金颗粒的TEM表征60
• 4.3.3 生物条码的紫外-可见光谱表征60
• 4.3.4 实验条件的优化60-62
• 4.3.4.1 杂交链式反应时间的优化60-61
• 4.3.4.2 杂交链式反应比例的优化61-62
• 4.3.4.3 HCR反应温度的优化62
• 4.3.4.4 缓冲溶液pH值的优化62
• 4.3.5 miRNA-203和ATP不对称同时检测62-63
• 4.3.6 不对称同时检测ATP和miR-203的实际应用63-64
• 4.4 小结64-65
• 结论65-66
• 参考文献66-74
• 致谢74-75
• 攻读学位期间发表的学术论文目录75-76

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