产氢细菌Klebsiella sp. WL1316的筛选及其发酵棉秆水解糖液合成生物氢的代谢调控

发布时间：2020-03-18 21:58

【摘要】：在化石能源储量不断减少、环境压力不断凸显的双重压力下,充分利用木质纤维素等可再生资源来开发清洁能源受到举世关注。氢能是目前已知最为清洁的可再生能源,在氢气的生产方式中,以木质纤维素原料为基质进行微生物暗发酵产氢是重要的途径之一,这其中发酵菌种的选择至关重要。然而,自然界中,单一野生菌株发酵产氢的氢产量相对较低,因此在很长时期,研究工作多集中于高效产氢菌种的筛选上。同时,秸秆类生物质原料中的木质纤维素或其水解物的成分较复杂,木糖往往不能为产氢细菌所利用,为此,筛选能水解木质纤维素或代谢木糖的产氢菌株,显得尤为重要。棉秆是新疆分布最广泛的生物质原料,年产量可达数百万吨。近年来棉秆的高值化利用备受关注,棉秆高值化产品的开发也呈现多样化,已有研究报道能将棉秆水解糖液发酵转化为高值化产品,如乙醇、木糖醇、单细胞油脂等。然而,极少有关于产氢细菌发酵棉秆水解糖液合成生物氢的报道。为获得能高效发酵棉秆水解糖液合成生物氢的产氢细菌,本论文从塔里木流域野生鲤鱼肠道分离、筛选获得一株产氢细菌Klebsiella sp.WL1316,用其发酵棉秆水解糖液产氢,对其发酵条件进行筛选,并对发酵过程进行放大和调控,实现了棉秆水解糖液中木糖和葡萄糖的共利用,获得了高的生物氢产量。进一步基于Klebsiellasp.WL1316的基因组信息,重构了菌株兼具葡萄糖、木糖利用和发酵产氢的代谢网络,结合对发酵产氢过程中关键酶和关键节点代谢物的代谢通量分析,阐明了菌株发酵产氢的代谢基础。具体研究内容如下:1.从塔里木河流域野生鲤鱼肠道分离、筛选获得一株产氢细菌WL1316,经形态、生理生化及16SrDNA序列鉴定为Klebsiellasp.。研究发现该菌具备共利用葡萄糖和木糖发酵产氢的能力,其以棉秆水解糖液为糖基质,发酵24 h的产氢量、产氢速率和氢产率分别可达554.0 ± 22.6 mL/L、23.1 ± 0.9 mL/(L·h)、0.33 ± 0.01 mL/(L.mol sugarconsumed),表明该菌株具备利用棉秆水解糖液高效合成生物氢的潜力。进一步确定该菌株最佳的发酵条件为:起始糖浓度40 g/L,发酵温度37℃,发酵起始pH值8.0,在此发酵条件下,采用修正的Gompertz方程拟合累积产氢量的动力学参数Rm值与P值均达到最大,表明Klebsiella sp.WL1316具有较高的发酵产氢速率和产氢潜力。2.基于已获得的Klebsiella sp.WL1316发酵棉秆水解糖液产氢的最佳发酵条件,在5 L发酵罐中开展了放大实验,获得了更高的产氢生产力:最大日均产氢量达937.0 ± 41.0 mL/(L.d),累积产氢量达2908.5 ± 47.4 mL/L,活菌计数达(20.2±0.6)×108 CFU/mL,生物氢产率达1.44±0.08 mol/molsugarconsumed,同时也获得了较高的葡萄糖和木糖利用率,表明该菌株具备较强的将棉秆水解糖液中的葡萄糖和木糖转化为生物氢的能力。分段调控pH值处理可有效缓解发酵液中由于酸性代谢物产生引起的pH值急剧降低,显著提高菌株的日均产氢量和累积产氢量,促进葡萄糖和木糖的利用及菌株的生长。相较而言,分段控温处理并不能显著提高菌株的日均产氢量和累积产氢量,但却可在一定程度上促进葡萄糖和木糖的利用及菌株的生长。3.对产氢细菌Klebsiella sp.WL1316进行了全基因组测序,基于基因组注释结果,从菌株比对的KEGG代谢途径中获得了菌株利用葡萄糖的主要代谢途径,及以丙酮酸为中间代谢物的发酵产氢途径。进一步对基于COG分类的功能蛋白进行分析,发现木糖通过异构化为木酮糖,并进一步磷酸化为木酮糖-5-磷酸,进入磷酸戊糖途径进行代谢。此外,该菌株还具有多样的氢酶和甲酸氢裂解酶功能蛋白,且在数量分布上优于一些近缘属的细菌。在此基础上,重构了菌株兼具葡萄糖、木糖利用和发酵产氢的代谢网络。基于重构的代谢网络,检测并分析了Klebsiellasp.WL1316生物氢合成关键代谢支路的酶活性,并对关键节点代谢物进行了代谢通量分析。结果显示发酵周期内葡萄糖及木糖有效得到代谢,推动了菌株细胞物质的合成和发酵途径的进行。发酵24 h,丙酮酸快速进行脱羧转化,为其它代谢支路提供了碳骨架。在发酵48 h后,甲酸大量裂解用于生物氢合成,但在24～48 h阶段丙酮酸节点的代谢流部分流向三羧酸循环。在发酵48～72 h,乳酸合成支路成为主要竞争支路。在72 h之后,乙酸和乙醇合成的代谢支路在发酵后期对生物氢合成起到了较主要的竞争作用。基于拟稳态构建的菌株发酵产氢过程代谢网络亦证明了上述代谢过程。基于上述分析,可认为在发酵中后期(48～96h),需要较好地调控生物氢合成的竞争支路才能有效提高生物氢产量。
【图文】：

专性厌氧菌,梭菌,产氢,代谢途径

实现不同水平上对暗发酵产氢过程进行有效调控。逡逑最典型的暗发酵产氢代谢途径主要有两条：一是以梭菌属为代表的专性厌氧菌的逡逑丁酸发酵途径（图１－２），，另一是以肠杆菌属为代表的兼性厌氧菌的混合酸发酵途径（图逡逑１－３）。在丁酸发酵途径中，可通过敲除基因阻断丙酮酸生产乳酸的支路、敲除逡逑冰７基因阻断生产甲酸的支路、敲除ａｃｔ声ａ基因阻断乙酰ＣｏＡ生成乙酸的支路、敲逡逑除似基因阻断乙酰ＣｏＡ生成乙酰乙酰ＣｏＡ的支路、敲除五基因阻断乙酰ＣｏＡ生逡逑产乙醇的支路、敲除吸氢酶基因或超量表达一些酶基因，在基因水平上实现产氢代谢逡逑途径的调控，从而提高生物氢产量。Ｌｉ等（２０１０）敲除了嗜热厌氧杆菌逡逑ＴＴｚｅ削似ｅ邋中的邋基因，使l#的产量提尚了邋２邋倍［１３２］。Ｌｉｕ逡逑等（２００６）通过基因敲除使酪丁酸梭菌中编码ｉ酸激酶的ａｏｆｅ基因失活，使氢产量提逡逑高了邋１．５邋倍［１３３］。Ｓｏｏ邋等（２０１７）在逦ｃｏ／／邋ＳＳ１邋中分别同源表达／基因、逡逑异源表达梭菌办必基因，氢产量相较野生型菌株分别提高了邋４１％、２０％［１３４］。Ｍｏｒｉｍｏｔｏ逡逑等（２００５）在梭菌Ｃ／ｏｒｆｒｚＷ／ｗｍ／ｗｍ／ｗｒｒｉ／ｆｃ灥Ｍ－２１中超量表达办必基因，提高了氧逡逑产量

肠杆菌属,兼性厌氧菌,产氢,代谢途径

实现不同水平上对暗发酵产氢过程进行有效调控。逡逑最典型的暗发酵产氢代谢途径主要有两条：一是以梭菌属为代表的专性厌氧菌的逡逑丁酸发酵途径（图１－２），另一是以肠杆菌属为代表的兼性厌氧菌的混合酸发酵途径（图逡逑１－３）。在丁酸发酵途径中，可通过敲除基因阻断丙酮酸生产乳酸的支路、敲除逡逑冰７基因阻断生产甲酸的支路、敲除ａｃｔ声ａ基因阻断乙酰ＣｏＡ生成乙酸的支路、敲逡逑除似基因阻断乙酰ＣｏＡ生成乙酰乙酰ＣｏＡ的支路、敲除五基因阻断乙酰ＣｏＡ生逡逑产乙醇的支路、敲除吸氢酶基因或超量表达一些酶基因，在基因水平上实现产氢代谢逡逑途径的调控，从而提高生物氢产量。Ｌｉ等（２０１０）敲除了嗜热厌氧杆菌逡逑ＴＴｚｅ削似ｅ邋中的邋基因，使l#的产量提尚了邋２邋倍［１３２］。Ｌｉｕ逡逑等（２００６）通过基因敲除使酪丁酸梭菌中编码ｉ酸激酶的ａｏｆｅ基因失活，使氢产量提逡逑高了邋１．５邋倍［１３３］。Ｓｏｏ邋等（２０１７）在逦ｃｏ／／邋ＳＳ１邋中分别同源表达／基因、逡逑异源表达梭菌办必基因，氢产量相较野生型菌株分别提高了邋４１％、２０％［１３４］。Ｍｏｒｉｍｏｔｏ逡逑等（２００５）在梭菌Ｃ／ｏｒｆｒｚＷ／ｗｍ／ｗｍ／ｗｒｒｉ／ｆｃ灥Ｍ－２１中超量表达办必基因，提高了氧逡逑产量
【学位授予单位】：北京化工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ116.2;TQ920.1

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