氧化葡萄糖酸杆菌静息细胞催化合成2KGA和GA的研究

发布时间：2020-05-16 14:14

【摘要】：2-酮基-D-葡萄糖酸(2KGA)和葡萄糖酸(GA)作为化学中间体被广泛应用于食品、制药、建筑等领域。目前用来生产2KGA和GA的方法主要是微生物发酵法,但发酵法存在副产物较多,底物和产物抑制等问题。本研究利用基因同源过表达技术,分别对本实验室前期筛选得到的菌株G.oxydans DSM 2003和G.oxydans#1进行改造,构建并筛选了生产2KGA及GA的高产过表达菌株,分别优化了重组菌株催化合成2KGA和GA的条件,建立了利用静息细胞催化法高效生产2KGA的新工艺。现在分别从合成2KGA和GA两个方面将主要研究成果总结如下:第一部分,关于催化合成2KGA的主要成果及结论1.成功构建并筛选了一株生产2KGA的高产菌株(1)以G.oxydansDSM2003为原始菌株,利用基因同源过表达技术,成功构建并筛选了一株生产2KGA的高产菌株Goxydans_tufB_ga2dh。该重组菌株催化效率比对照菌株提高了97%。(2)在重组菌株中,葡萄糖酸-2-脱氢酶三个亚基的基因goox1230,gox123 和gox1232的转录水平分别是对照菌株中相对应基因转录水平的162倍,44倍和59倍,这说明ga2dh基因在重组菌株中成功过量表达。(3)在7L发酵罐中,细胞浓度30g/L,GA浓度为320g/L,重组菌株生产2KGA的时空产率比原始菌提高了约111%。2.优化了重组菌株静息细胞催化GA生产2KGA的条件(1)在通空气的条件下,比较合适的催化条件是:细胞浓度30 g/L,GA浓度为320 g/L,pH5.8,温度30℃。相应的底物转化率约为100%,时空产率为12.76g/L/h,产物2KGA浓度为218 g/L,产率99%。底物浓度高于320 g/L时,反应速度随浓度增加而降低,高浓度底物对细胞催化活性产生显著的抑制。(2)溶氧是影响GA转化为2KGA的重要因素。溶氧不足会显著制约催化反应速度。但过高的溶氧条件会导致反应体系中静息细胞催化活性的丧失。(3)在通入氧气的条件下,60 g/L静息细胞可在45h内将480 g/L的GA完全转化为2KGA,产物浓度达到453 g/L,产率95.3%,时空产率达到10.07 g/L/h。与文献已报道的结果相比,本研究获得的产量处于领先水平。(4)初步建立了反应所得产物的初步纯化流程,得到无色透明晶体,经检验,晶体为2KGA(钠盐),纯度为98.9%。3、优化了重组菌株静息细胞催化葡萄糖生产2KGA的条件(1)在通入空气的条件下,当细胞浓度为60 g/L,葡萄糖浓度为200 g/L时,重组菌株用21h可将全部底物催化生成2KGA,时空产率最高为11.2g/L/h,2KGA浓度为234.6 g/L,产率98%。时空产率比原始菌株提高了 365%。(2)研究了补料分批和连续流加对催化反应的影响。结果表明,补料分批的方式对催化效率提升比较明显。当细胞浓度为60 g/L时,在250 g/L和300 g/L的底物条件下,可分别提升催化效率15%和24%。(3)在通入氧气的条件下,30 g/L静息细胞可在21h内将270 g/L的葡萄糖完全转化为2KGA,产物浓度达到316g/L,产率97%,时空产率达到15.0 g/L/h。与现有文献相比,本研究所获得的2KGA的产量与时空产率达到了领先水平。第二部分,关于合成GA的主要成果及结论1.成功构建并筛选了生产GA的高产菌株。以本实验室前期筛选得到的菌株G.oxydans#1为原始菌株,利用基因同源过表达技术,成功构建并筛选了高产GA的菌株G.oxydans#1_PtufB_g dh,该重组菌株的催化效率比原始菌株提高了14%。2.研究了葡萄糖浓度对重组菌株催化葡萄糖生成GA的影响。在通入空气并且细胞浓度40 g/L的条件下,确定了适宜的底物葡萄糖浓度为250 g/L至300 g/L。在优化条件下,重组菌株可在20h将所有葡萄糖消耗完毕,生成的GA浓度为313 g/L,2KGA浓度为38 g/L。GA的时空产率为15.65 g/L/h,GA的产率为89%。时空产率比原始菌株提高了 115%。3.使用补料分批的方法,40 g/L重组菌株静息细胞可以在32h内完全转化400 g/L的葡萄糖,生成371 g/L GA和40 g/L 2KGA,GA的时空产率为11.6 g/L/h,选择率为93%。
【图文】：

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图１．１邋Ｇ．邋ｏｘｊＹ／ｆｌ／ｗ在电子显微镜下的形态逡逑ｉｇ．邋１．１邋Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ邋ｏｘｙｄａｎｓ邋ｕｎｄｅｒ邋ｔｈｅ邋ｅｌｅｃｔｒｏｎ邋ｍｉｃｒｏ件逡逑Ｇ．ｏｘ；＾ａｍ特别适合在含糖丰富的水果和花卉环境中

葡萄糖,醋酸杆菌属,醋酸杆菌,醋酸菌

根据生物学分类，醋酸杆菌科科由三个属组成，，它们分别是逡逑也如■及（７／ｗｃｃｗｆｌｃｅｆｏ／＾ｔｏ＊邋（葡萄糖酸醋酸杆菌属）［９＿１２］。0．ｏｘｊｄｍｓ１逡逑归属于葡萄糖杆菌属（Ｇ／ｗｃｏｍ）６ｆｌｃｔｏ０邋（图１．２）0逡逑Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ逡逑Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ邋＾邋Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ逦Ｇ．邋ａｌｂｉｄｕｓ逡逑Ｏｘｙｄａｎｓ逡逑Ｇ．邋ｃｅｒｉｎｕｓ逡逑Ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ逡逑Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ邋＂ｎ邋＿逦．逡逑Ｇ．邋ｏｘｙｄａｎｓ逡逑Ｉｎｄｕｓ邋ｔｒｉｕｓ逡逑Ｇ．邋ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｓ逡逑＿逦＾邋Ｍｅｌａｎｏｇｅｎｕｓ逡逑Ｇ．邋ｆｒａｔｅｕｒｉｉ逡逑Ｆａｍｉｌｙ逦Ｇｅｎｅｒａ逦Ｓｐｅｃｉｅｓ逦Ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ逡逑图１．２邋Ｇ１．逦生物学分类图逡逑Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ邋ｔｒｅｅ邋ｏｆ邋Ｇ．邋ｏｘｙｄａｎｓ逡逑按照１６ｓｒＲＮＡ测序结果分析，葡萄糖杆菌属由５个种组成，除了Ｇ．邋ｗｑｙＡ／ｒａ种外，还逡逑有其它４个种，它们分别是Ｇ．逦Ｇ．逦Ｇ户Ｙ／／ｅｗｒ／／，和（７．逦Ｍ邋（图邋１．２）。逡逑Ｇ逦种可进一步分为四个亚种［１４］，如图１．２所示。逡逑Ｇ／ｗｃｃｗｏＺ？ａｃｒｅｒ属与ｄｃｅｆｏｈｃ／ｅｒ属紧密相关，并被归类为醋酸菌（ａｃｅｔｉｃ邋ａｃｉｄ邋ｂａｃｔｅｒｉａ）逡逑Ｈ。Ｇ／ｗｃｃ聊？属与Ｊｃｅ／ｏ６（７ｃ／ｗ属有两个显著的区别：一是Ｇ／ｗｏ胤属具有不逡逑完全的三羧酸循环（ＴＣＡ）酶，特别是缺乏琥珀酸脱氢酶，阻止了代谢途径的完整运作，逡逑而具有完整的、在末端氧化起作用的三竣酸循环（ＴＣＡ）酶。结果
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ033

【参考文献】