产气肠杆菌（E.aerogenes）ComplexⅠ与氢代谢关系的研究

发布时间：2021-03-11 20:47

　　能源是人类社会生存和发展的基本条件,针对传统化石能源面临的严峻挑战,寻求新的可再生的替代能源是当今能源发展的趋势,而氢作为优良的能源载体得到了广泛的关注。产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）是一种极具应用前景的兼性厌氧产氢菌,它能广泛地利用各种碳源生长,产氢速率较高,具有工业应用的潜力。本研究通过敲除NADH脱氢酶亲水性亚基的基因（nuoCDE）,过表达小RNA RyhB和NAD合成酶三种方法增强产气肠杆菌产氢速率,并利用高压液相色谱（HPLC）和高效气相色谱分析突变株代谢流的再分配。本文运用CRISPR-Cas9基因编辑方法敲除产气肠杆菌IAM1183中的nuoCDE基因,得到了一株双敲除突变株IAM1183-CD（ΔnuoC/ΔnuoD）和一株三敲除突变株IAM1183-CDE（Δnuo C/Δnuo D/ΔnuoE）。100ml血清瓶厌氧发酵实验结果显示突变株IAM1183-CD,IAM1183-CDE的产氢量相较于原始菌分别增加了24.5%,45.6%。其中菌株IAM1183-CDE的NADH产氢途径的产氢量显著增加表明nuoE基因在调节胞内NADH浓度的... 

【文章来源】：浙江理工大学浙江省

【文章页数】：80 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
第一章 引言
    1 氢能源前景概述
        1.1 传统化石能源面临的问题
        1.2 生物炼制的重要性
        1.3 生物法制氢的生产方法
            1.3.1 热转化制氢
            1.3.2 生物转化制氢
    2 发酵生物制氢的研究进展
        2.1 发酵制氢菌株及其底物利用能力
        2.2 发酵制氢代谢途径
            2.2.1 专性厌氧菌产氢途径
            2.2.2 兼性厌氧菌产氢途径
        2.3 微生物存在的氢酶
            2.3.1 发酵制氢过程所涉及的氢酶
            2.3.2 NADH氢酶与NADH脱氢酶的关系
    3 小RNA RyhB的结构与功能
        3.1 小RNA RyhB的结构
        3.2 小RNA RyhB的功能
    4 本论文的研究对象产气肠杆菌
    5 本课题的研究意义和技术路线
        5.1 研究意义与立题思想
        5.2 研究技术路线
        5.3 研究内容
第二章 材料与方法
    1 材料
        1.1 菌株和质粒
        1.2 引物
        1.3 基因操作实验相关的酶以及试剂盒列表
        1.4 培养基、培养条件及常用试剂的配置
    2 实验方法
        2.1 质粒提取
        2.2 基因组DNA的小量提取
        2.3 琼脂糖凝胶中DNA回收（PCR产物DNA回收）
        2.4 基因克隆
            2.4.1 引物储存液与工作液的制备
            2.4.2 PCR反应体系的配方
            2.4.3 PCR扩增程序
            2.4.4 菌落PCR
        2.5 DNA片段的酶切与连接
        2.6 DNA片段overlap PCR连接
        2.7 多片段连接及其环化
        2.8 转化
            2.8.1 大肠杆菌电激感受态细胞的制备
            2.8.2 大肠杆菌电激转化
            2.8.3 大肠杆菌化学感受态细胞的制备
            2.8.4 大肠杆菌CaCl2法转化
        2.9 琼脂糖凝胶电泳分析
        2.10 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
        2.11 RNA提取及Northern Bolt
            2.11.1 基因组RNA提取
            2.11.2 Northern转膜
        2.12 发酵液中葡萄糖含量的测定
        2.13 氢酶酶活的检测方法
            2.13.1 LDH、ADH和BDDH酶活的测定
        2.14 基于CRISPER-CAS9基因整合技术
            2.14.1 CRISPER-CAS9基因整合技术操作步骤
第三章 敲除菌株及质粒的构建
    1 构建基因工程菌株IAM1183-CD和IAM1183-CDE
        1.1 引言
        1.2 敲除菌株和引物
        1.3 敲除结果
            1.3.1 IAM1183-CD敲除结果
    2 构建外源表达小RNA RyhB表达载体
        2.1 引言
        2.2 菌株和质粒
            2.2.1 携带有氯霉素抗性RyhB表达载体的构建
        2.3 Northern Bolt验证
    3 构建外源表达Nad合成酶表达载体
        3.1 引言
        3.2 Nad合成酶表达载体的构建
        3.3 SDS-PAGE验证
    4 小结与讨论
第四章 基因工程菌株功能检测及发酵产氢结果
    1 各菌株生长曲线和pH
    2 各菌株血清瓶批式发酵产氢量及代谢产物含量
        2.1 测定发酵液中有机酸和醇类的含量
        2.2 发酵液中葡萄糖含量的测定
        2.3 结果与分析
    3 各菌株产氢代谢途径和氢酶酶活分析
        3.1 各菌株甲酸途径与NADH产氢途径分析
        3.2 各菌株NADH依赖型氢酶酶活分析
    4 发酵罐发酵制氢
    5 小结与讨论
第五章 总结
参考文献
攻读硕士学位期间的研究成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]中国在氢能利用上具备得天独厚优势[J]. 明平文.  时代汽车. 2017(04)
[2]新常态下中国能源供给侧改革的路径探析——基于产能、结构和消费模式的视角[J]. 岳立,杨帆.  经济问题. 2016(10)
[3]生物质能研究进展[J]. 吴业颖.  科技资讯. 2008(08)
[4]Pyrolysis of rice husk and sawdust for liquid fuel[J]. ZHU Xi-feng*, ZHENG Ji-lu, GUO Qing-xiang, ZHU Qing-shi (Biomass Clean Energy Laboratory, University of Science and Technology of China, Hefei 230026, China.).  Journal of Environmental Sciences. 2006(02)
[5]“氢经济”与氢能发展战略的思考[J]. 王革华,戴志远.  太阳能. 2005(03)



本文编号：3077070