基于TUDCA生物转化的固定化酶填充床反应器流场模拟及实验研究

发布时间：2017-08-09 02:15

  本文关键词：基于TUDCA生物转化的固定化酶填充床反应器流场模拟及实验研究

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【摘要】：目前牛磺熊去氧胆酸(Tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)主要利用人工提取熊胆汁的方式来获得,但由于熊胆资源的稀缺性和来源的特殊性使TUDCA的产量远远不能满足临床用药需求。本文在本课题组提出的双酶偶联固定化酶促反应生产TUDCA方法的基础上,着眼于高效固定化酶生物反应器的开发,应用FLUENT软件模拟分析了填充床反应器内的流场,探讨了流速和反应器高径比对反应器流场分布的影响,并进一步通过实验对模拟的结果进行验证和分析,获得了能在一定程度上代替实验过程的CFD模型。研究将为进一步反应器的设计提供理论和实验依据。本课题来源于项目编号为2014ZX09301306-007的国家科技重大专项新药创制项目,主要研究内容及结果如下:(1)应用pGEX-6p-1和GST融合基因表达系统对7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-HSDH)和7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)进行了表达和纯化,并以壳聚糖为载体对7α-HSDH和7β-HSDH进行了固定。1)通过GST一步亲和纯化获得了7α-HSDH和7β-HSDH游离酶,电泳分析为具有唯一清晰且较宽的条带,酶的浓度分别为1.776mg/mL和2.059mg/m L,酶比活分别为24.16U/mg和49.36U/mg。2)应用戊二醛活化的壳聚糖微球对7α-HSDH和7β-HSDH进行固定化,结果表明两种酶的固定率均大于98%。(2)利用双酶偶联共固定对TUDCA进行生物转化,优化获得了该双酶偶联共固定系统的适宜pH值、温度和底物浓度,为进一步的实验研究确定了酶促反应的最佳参数。结果发现:1)pH值在7到11范围内变化,固定化酶对TUDCA转化效率为pH9Ph11Ph10pH8pH7,因此最适p H值为9。2)当温度从5℃到60℃变化时,固定化酶催化效率先缓慢升高,然后急剧降低,固定化酶对TUDCA转化效率为25℃15℃5℃37℃45℃60℃,因此最适温度为25℃。3)当底物浓度从5mM到25mM变化时,固定化酶催化能力先增强,后减弱,固定化酶对TUDCA转化效率为10mM15mM20mM25Mm5Mm,因此最适底物浓度为10mM。(3)应用FLUENT 6.3软件对填充床反应器的流场进行了模拟分析,研究了循环流速和反应器高径比对流场的影响。我们发现:1)当反应器高径比一定时,流场的均匀性随着流速的增大而增大,这将使底物与酶的接触越充分,越有利于酶促反应的进行。2)在一定流速下,改变高径比,高径比越大,液体流过的相对横截面积相同,但是液体在反应器中的滞留时间越长,致使底物与酶接触时间越长,越有利于酶促反应的进行。(4)采用固定化酶填充床反应器研究验证了循环流速和反应器高径比对TUDCA生物转化的影响。1)在高径比为30:16,循环流速分别为1mL/min,2m L/min,4mL/min的反应器中,通过比较体积生产效率,结果表现为4mL/min2m L/min1m L/min,与模拟实验结果相符。2)在流速为2mL/min,高径比分别为30:16,60:16,100:16的反应器中,通过比较平均单次循环生成TUDCA的量,结果表现为100:1660:1630:16,与模拟实验结果相符。通过实验验证,表明本课题建立的CFD模型可以用于填充床反应器固液两相流动过程的数值模拟研究,在一定程度上能够代替实验过程。
【关键词】：填充床反应器 流场模拟 固定化酶 HSDH TUDCA
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TQ052;Q814
【目录】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-10
• 1 绪论10-23
• 1.1 牛磺熊去氧胆酸国内外研究现状10
• 1.2 牛磺熊去氧胆酸制备方法及研究现状10-12
• 1.2.1 化学合成法11-12
• 1.2.2 生物催化法12
• 1.3 生物酶反应器简介12-16
• 1.3.1 连续搅拌釜式反应器(CSTR)13-14
• 1.3.2 填充床式反应器(PBR)14-15
• 1.3.3 流化床式反应器(FBR)15-16
• 1.4 固定化酶技术的研究现状16-19
• 1.4.1 固定化酶载体材料16-17
• 1.4.2 酶固定化方法17-19
• 1.5 计算流体动力学概述19-22
• 1.5.1 FLUENT软件介绍20-22
• 1.6 课题思路及意义22-23
• 2 7α-HSDH和 7β-HSDH表达与固定23-33
• 2.1 实验材料23-25
• 2.1.1 材料与药品23-24
• 2.1.2 设备与仪器24-25
• 2.2 实验方法25-28
• 2.2.1 7α-HSDH和 7β-HSDH的表达与纯化25-27
• 2.2.2 固定化酶载体的制备及酶的固定27-28
• 2.3 实验结果28-32
• 2.3.1 7α-HSDH和 7β-HSDH的SDS-PAGE凝胶电泳图28-29
• 2.3.2 BCA法检测 7α-HSDH和 7β-HSDH浓度29
• 2.3.3 7α-HSDH和 7β-HSDH游离酶活性检测结果29-31
• 2.3.4 酶的固定率检测结果31-32
• 2.4 小结32-33
• 3 固定化酶对TUDCA转化条件的优化33-41
• 3.1 实验材料33-34
• 3.1.1 材料与药品33
• 3.1.2 设备与仪器33-34
• 3.2 实验方法34-36
• 3.2.1 pH对固定化酶底物转化的影响34
• 3.2.2 温度对固定化酶底物转化的影响34
• 3.2.3 底物浓度对固定化酶底物转化的影响34-35
• 3.2.4 固定化酶 4℃贮存条件下的酶活回收率35
• 3.2.5 高效液相色谱分析35-36
• 3.3 实验结果与分析36-40
• 3.3.1 TUDCA、T7KLCA、TCDCA的HPLC标准曲线36-38
• 3.3.2 pH对TUDCA转化效率的影响38
• 3.3.3 温度对TUDCA转化效率的影响38-39
• 3.3.4 底物浓度对TUDCA转化效率的影响39
• 3.3.5 固定化酶 4℃贮存条件下的酶活力回收率39-40
• 3.4 小结40-41
• 4 FLUENT模拟分析41-52
• 4.1 利用Gambit建立固定化酶反应容器的计算模型41-43
• 4.1.1 Gambit绘制反应容器简图41
• 4.1.2 网格的划分41-42
• 4.1.3 设置边界类型及输出Mesh文件42-43
• 4.2 利用FLUENT设置计算参数43-44
• 4.3 Tecplot处理计算结果显示44-51
• 4.3.1 循环流速对流场的影响44-48
• 4.3.2 高径比对流场的影响48-51
• 4.4 小结51-52
• 5 固定化酶反应器实验验证52-58
• 5.1 固定化酶反应器实验平台的搭载52
• 5.2 实验材料52-53
• 5.2.1 材料与药品52-53
• 5.2.2 设备与仪器53
• 5.3 实验方法53-54
• 5.3.1 循环流速对底物转化的影响53-54
• 5.3.2 反应容器径高比对底物转化的影响54
• 5.4 实验结果及分析54-56
• 5.4.1 循环流速对底物转化的影响54-56
• 5.4.2 高径比对底物转化的影响56
• 5.5 小结56-58
• 6 总结58-60
• 致谢60-61
• 参考文献61-65
• 附录65-67
• 附录A (3.3.2)65-66
• 附录B (3.3.3)66-67
• 附录C (3.3.4)67

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1 陈丽俐;基于TUDCA生物转化的固定化酶填充床反应器流场模拟及实验研究[D];重庆大学;2016年

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