钛表面噬菌体基质膜的制备及其生物学性能评价

发布时间：2020-07-23 23:47

【摘要】：理想的骨植入体应具有适度的免疫调节和诱导骨形成的能力。钛种植体虽已广泛用于硬组织植入领域,但其表面缺乏一定的生物活性,并会引起植入体周围组织的炎症响应。基于噬菌体展示技术得到的材料特异性结合噬菌体不仅可以在材料表面形成稳定的生物基质,调控粘附细胞/组织的生物功能,也可结合化学修饰的手段为细胞生长提供多肽、药物分子等生化信号。转化生长因子β1(TGF-β1)在炎症反应及组织的创伤愈合中发挥重要作用。适当改善TGF-β1对炎性及组织细胞的调控,可促进骨组织的愈合,并减少植入体周围纤维化的发生。本研究从M13噬菌体随机展示肽库中淘选得到可与酸碱处理的钛表面特异性结合的钛结合肽-噬菌体(TBP-phages),并利用该噬菌体对钛表面进行生物改性。为赋予钛表面更多的生物功能性,3种TGF-β1亲和肽化学结合到噬菌体膜表面。通过与间充质干细胞(MSCs)、巨噬细胞的体外培养及动物体内骨植入实验,综合评价钛种植体表面不同噬菌体膜对炎性响应及骨整合的调控能力,优选具有骨免疫调节功能的噬菌体修饰的钛种植体。首先,淘选得到可与酸碱处理的钛表面(AA)特异性结合的钛结合肽-噬菌体,经DNA测序获得结合肽TBPs的序列。通过探究噬菌体TBP54-phage与AA表面的结合机制,发现TBP54-phage主要通过TBP54序列中的FAETHR片段与钛表面羟基,特别是碱性羟基基团,通过配位及静电作用结合。这种作用受钛表面物理结构及化学基团的共同调控,延长碱处理时间,可提高噬菌体对钛表面的亲和性。将TBP54-phage悬液均匀涂覆于钛表面,得到纳米纤维多孔的噬菌体膜。该噬菌体膜具有良好的稳定性和基底选择性。噬菌体悬液中加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP),可以提高噬菌体膜(APP)的组织均一性。由噬菌体和壳聚糖形成的复合膜,相比单纯的壳聚糖膜,具有更好的亲水性、耐降解性和膜/基结合性。其次,比较了预处理钛表面、酸碱处理钛表面、钛表面噬菌体膜(APP)及戊二醛交联的噬菌体膜(APPG)在成骨分化、体外矿化及巨噬细胞炎性响应方面的性能。钛表面经酸碱处理后,成骨细胞粘附、分化和体外矿化得到改善,巨噬细胞的炎症响应也有所降低。与之相比,噬菌体膜更为显著地提高了钛表面的促成骨分化和体外矿化能力,并在巨噬细胞培养晚期显示更明显的炎症衰退。噬菌体膜经戊二醛交联后,生物学性能有所下将。接着,利用噬菌体展示技术淘选获得TGF-β1亲和肽(Tβms)。考察Tβms与TGF-β1间的亲和性发现,Tβm16具有相对较高的TGF-β1亲和性和较低的TGF-β1免疫反应活性封闭性,Tβm4则相反。Tβms单独作用可促进成骨细胞的早期增殖,但对细胞碱性磷酸酶(ALP)活性没有影响。与TGF-β1共同作用时,可增强成骨细胞的骨钙素表达、ALP活性和Ca沉积。这与Tβms调控的TGF-β1通路蛋白Smad2/3的磷酸化水平降低有关。为进一步考察Tβms对间充质干细胞(MSCs)成骨分化及巨噬细胞炎性响应的调控,将TGF-β1亲和肽Tβm4、Tβm14和Tβm16接枝于APP表面(TGF-β1亲和肽-噬菌体膜)。当噬菌体膜表面预先结合TGF-β1时,接枝Tβm14的噬菌体膜可显著促进MSCs的成骨分化及矿化,TGF-β1主要促进MSCs的早期成骨分化。在膜表面不含TGF-β1时,APP更有利于MSCs的矿化。将TGF-β1亲和肽-噬菌体膜与巨噬细胞共培养,TGF-β1亲和肽影响表面蛋白吸附、细胞整合素作用及早期炎性表达。巨噬细胞历经凋亡/炎性增强、炎性持续及表型转变后,进入炎性衰退阶段。表征不同阶段巨噬细胞的极化表型表明,噬菌体膜上调巨噬细胞的早期炎性表达,与TGF-β1亲和肽有关,并受TGF-β1促炎通路及NF-κB通路调控。随着TGF-β1/Smad抗炎通路的表达,巨噬细胞由促炎向抗炎表型转变。噬菌体膜中,Tβm4接枝表面炎性响应持续相对较长。最后,考察了不同噬菌体膜修饰的钛种植体在大鼠体内的前期炎性响应及后期骨整合性。相对酸碱处理的钛种植体,噬菌体膜显著提高了钛种植体表面的骨整合性,且APP在诱导骨形成方面具有最好的效果。在前7天的炎性响应中,Tβm4接枝的种植体表面巨噬细胞浸润较多,而Tβm16接枝表面有较多的多核巨噬细胞分布。由于受到前期炎性响应的影响,Tβm4接枝表面在2周时观察到纤维膜的形成,使得之后骨整合受到阻碍;而Tβm16接枝表面由于巨噬细胞的基质降解作用,前4周骨组织重塑较慢。三种TGF-β1亲和肽-噬菌体膜中,Tβm14接枝表面具有更好的骨整合性。综合而言,由钛结合肽-噬菌体与PVP制备的噬菌体膜具有较好的骨免疫调节性能。噬菌体膜接枝TGF-β1亲和肽虽然可调控成骨分化和炎性响应,但在正常骨愈合环境中没有体现出优势。
【学位授予单位】：西南交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TG174.4;R318.08
【图文】：

生物材料引起的巨噬细胞表型及功能的变化对骨愈合的影响

页 西南交通大学博士研究生学位论文性大分子复合物的前体形式沉积在细胞外基质中，且在被分泌前需要经工过程[186]，如图 1-2 所示。TGF-β1 最初被合成为一个含 390 个氨基酸残re-pro-TGF-β1），包含 N 端的信号肽 SP，潜活性相关蛋白（LAP）及成熟多数细胞都会以 LLC 形式（LTBP-LAP-TGF-β）分泌 TGF-β，但成骨细可有效分泌SLC（LAP-TGF-β），且SLC形式更易激活。SLC及LLC形式中其受体结合，不具有生物活性。TGF-β1 的活化需要脱离 LAP 释放出来变化暴露出来，使其可以与相应受体结合。

TGF-β1信号通路

【参考文献】

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本文编号：2768002